论文摘要
Ced-9是从动物线虫（C.elegance）中克隆出来的抗凋亡基因,属于Bcl-2家族,与哺乳动物中的抗凋亡基因Bcl-2同源。前人的研究结果已经证实凋亡抑制基因Bcl-XL和Ced-9能够促进植物细胞对生物和非生物胁迫的抗性,但是其作用机制仍知之甚少。本研究以烟草为模式材料,开展铝（Al）、盐诱导其细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）的研究,并通过转细胞凋亡抑制基因Ced-9/Bcl-2提高烟草和水稻的耐铝抗盐性及其机理分析,获得如下主要结果:1、用DNA ladder检测证明了Al诱导的植物细胞死亡是类似于凋亡的PCD过程。2、通过测定转基因烟草的相对根长、苏木精染色等指标,首次证明凋亡抑制基因Ced-9在烟草细胞内具有一定的促进耐Al功能。通过苏木精染色比较转基因和野生型烟草在不同Al浓度下根部Al的积累量,证实Ced-9可缓解Al胁迫下烟草根部Al的积累量。研究表明过量表达Ced-9的转基因烟草植株也表现出比野生型更强的抗盐能力。3、用DNA ladder检测比较转基因和野生型烟草在Al或盐胁迫条件下的植物细胞PCD,发现Ced-9能阻断Al或盐诱导PCD的发生,从而提高烟草的耐胁迫能力。4、研究发现Ced-9能通过下调植物细胞内Al和盐诱导的类天冬氨酸依赖性半胱氨酸蛋白酶（Caspases）的液泡酶（vacuolar processing enzyme,VPE）的表达水平,抑制Al和盐诱导的PCD发生。揭示PCD的负调控可能是潜在的耐Al机制之一,并且PCD的负调控作用对植物细胞耐受非生物胁迫具有广谱性。5、用荧光探针DCFH和Fluo-3结合共聚焦荧光显微技术,发现Al能显著诱导细胞内的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）增加。研究还发现凋亡抑制基因Ced-9不能抑制Al诱导的ROS增加,但能直接调节胞内钙离子(Ca2+)水平。暗示Ced-9作用于Al胁迫引起的ROS信号的下游并延迟了Al激活的Ca2+信号水平的升高。推测Ced-9在植物细胞中的耐Al机制可能是通过延迟细胞内的Ca2+信号水平的升高来抑制Al引起的PCD。6、研究表明Ced-9不直接上调受Al诱导的基因NtGDI1、parB、NtPox的表达,这些基因的表达能抑制Al胁迫激发的ROS所引起的脂质过氧化作用。说明Ced-9不直接抑制Al胁迫引起的脂质过氧化作用。7、此外,还将Ced-9和Bcl-2基因通过根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105介导转化水稻,获得以下结果:（1）将Bcl-2小片段连接到中间载体pGEM上以获得合适的酶切位点,构建中间载体pGEM-Bcl2,将酶切下来的Bcl-2小片段连接到载体pCAMBIA13011上,成功构建了表达载体pCAMBIA13011-Bcl2。（2）将pCAMBIA13011-Bcl2以及实验室已有的pCAMBIAl3011-Ced9通过农杆菌介导法转化水稻,用潮霉素对转基因种子筛选获得抗性植株,并进行PeR和Gus活性检测。（3）转基因植株后代遗传分析,获得转基因纯系,并用RT-PCR检测到转基因后代植株的基因表达。（4）利用Tail-PCR技术对其中一株转基因水稻进行了T-DNA插入位点检测。发现水稻基因组上对应位置在水稻8号染色体上。
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