蟾蜍灵诱导人结肠癌SW620、食管癌ECA109细胞凋亡的机制研究

论文摘要

目的通过蟾蜍灵作用于人结肠癌SW620及食管癌ECA109细胞株，观察蟾蜍灵对SW620、ECA109细胞增殖抑制、诱导凋亡的作用，研究蟾蜍灵在诱导细胞凋亡过程中对Stat3、p-Stat3、PARP、Survivin、Caspase-3蛋白表达的影响，分析其诱导凋亡的可能机制。为进一步应用于临床提供实验依据。方法1、蟾蜍灵不同剂量和时间作用于SW620、ECA109细胞，采用MTT法测定细胞活力，绘制增殖抑制曲线。2、采用瑞氏-吉姆萨染色法，光学显微镜下观察细胞形态学变化。3、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。4.、采用Western blot技术检测Stat3、p-Stat3、PARP、Survivin、Caspase-3蛋白的表达情况。5、统计学处理：每次实验重复3次，数据以x±s表示，采用SPSS16.0软件进行t检验和单因素方差分析。结果一、结肠癌SW620细胞1、蟾蜍灵以时间、剂量依赖性方式抑制SW620细胞增殖，24h、48h和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)分别为76.72±6.21、34.05±4.21、16.7±6.37nmol/L。2、20nmol/L蟾蜍灵作用SW620细胞24h后，形态学表现为M期阻滞，细胞出现双核及停滞于分裂中期。流式细胞仪结果显示出现明显的G2/M期阻滞，G2/M期细胞百分数由对照组的18.39±1.74%增至36.29±2.11%（p<0.001）。Western blot显示PARP无裂解，对凋亡无明显影响。80nmol/L蟾蜍灵作用SW620细胞24小时后，形态学可见典型的凋亡改变，表现为细胞膜完整，细胞质固缩，胞核固缩或碎裂，可见凋亡小体。出现明显的亚二倍体凋亡峰（sub-G1峰），亚二倍体细胞百分比为17.83±2.38%（vs对照组，p<0.001），PARP裂解。3、80nmol/L蟾蜍灵分别作用SW620细胞124h，p-Stat3蛋白在1h即开始上调，6h达高峰，12h开始下降，至24h下降明显，而总的Stat3蛋白水平没有变化,提示蟾蜍灵可抑制Jak-Stat3信号通路。20μmol/L AG490（Jak特异性抑制剂）预先处理细胞1h后加入80nmol/L的蟾蜍灵作用1h和6h，未检测到p-Stat3蛋白的表达，提示20μmol/L AG490可抑制p-Stat3活化。20μmol/L AG490预先处理SW620细胞1小时，然后加入80nmol/L的蟾蜍灵继续作用24h，MTT结果显示细胞增殖率由单药蟾蜍灵组的49.97±2.52%下降至38.61±2.9%（P=0.007）。流式细胞仪分析显示细胞凋亡率由19.69±1.63%增加至34.63±2.57%（P=0.002）。Western blot解析结果显示PARP裂解明显增加，而AG490单独作用24h仅轻度抑制SW620细胞增殖，诱导少量细胞凋亡，PARP无裂解，提示AG490通过抑制p-Stat3增强蟾蜍灵抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。二、食管癌ECA109细胞1、蟾蜍灵以时间、剂量依赖性方式抑制ECA109细胞增殖，24h、48h和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度（IC50）分别为88.12±5.38、38.19±4.81、14.05±7.29nmol/L。2、蟾蜍灵诱导ECA109细胞凋亡，20、40、80nmol/l蟾蜍灵处理ECA109细胞24h，与对照组相比，ECA109细胞凋亡率分别为4.83%±0.47%、9.57%±0.56%、19.83%±2.38%（均p<0.05）。3、20、40、80nmol/L蟾蜍灵分别作用细胞24h，Western-blot检测结果显示，Survivin蛋白表达分别下调至作用前的（79.14±5.32）%，（59.03±7.21）%和（29.49±5.67）%（均P<0.05）。20nmol/L蟾蜍灵作用细胞24h只检测到非活化状态32KD的Procaspase-3，而80nmol/L组可检测到17KD的活性亚基。结论1、蟾蜍灵以时间、剂量依赖性方式抑制人结肠癌SW620及食管癌ECA109细胞增殖。2、蟾蜍灵在低浓度时诱导SW620细胞M期阻滞，较高浓度时诱导凋亡。在诱导细胞凋亡过程中抑制Jak-Stat3通路。预先抑制Jak-Stat3通路可增强蟾蜍灵抑制SW620细胞增殖、诱导其凋亡的作用。3、蟾蜍灵在诱导ECA109细胞凋亡过程中，下调Survivin蛋白表达，活化Caspase-3。

论文目录

• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 英文缩略语表
• 论文一
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文二
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介