猪细小病毒S-1株VP2和NS1基因的原核表达及其间接ELISA的初步建立

论文摘要

本试验利用PCR技术从猪细小病毒S-1株中成功扩增了VP2和NS1基因的片段,然后将PCR产物分别克隆至载体pET32c,构建了的重组质粒pET32c-VP2和pET32c-NS1原核表达载体。经双酶切和测序分析鉴定,结果表明重组表达质粒构建正确可靠。含有猪细小病毒结构蛋白VP2基因的重组质粒,转入表达宿主菌BL21中,IPTG进行诱导表达。确定IPTG终浓度为0.3-0.6mmol/L,37℃培养6h时表达量最佳。SDS-PAGE电泳结果显示,重组VP2蛋白获得高效表达,且以包涵体形式存在。Western-Blot显示有良好的免疫原性。变性、复性后回收率较低为30%。Ni2+树脂进行层析纯化,纯化后的蛋白浓度为0.63 mg/ml,纯度达75%。确定NS1优化表达的条件为IPTG终浓度为0.3-0.6mmol/L,20℃培养16h时表达效果好,且减少了包涵体的形成。Western-Blot显示有良好的生物活性。纯化后计算得浓度为0.50 mg/ml。纯化后的重组蛋白作为抗原,分别包被酶标板,通过优化ELISA反应条件,最终确定VP2、NS1包被浓度分别为3.1μg/ml、2.5μg/ml,血清稀释1:100、酶标二抗稀释度1:8000、血清和酶标二抗温育1h时效果最好。优化的最佳反应条件,建立的间接VP2-ELISA和NS1-ELISA分别检测6份阴性血清,将结果统计处理,确定阳性标准为OD待检血清≥0.5且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1。试验结果表明,建立的间接VP2-ELISA和NS1-ELISA特异性、敏感性效果较好。VP2-ELISA可以用于猪群疫苗正常免疫之后抗体水平高低的监测。NS1-ELISA且能很好的区别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1 猪细小病毒的病原特性
• 2 猪细小病毒的致病特性
• 3 猪细小病毒分子生物学研究
• 3.1 猪细小病毒基因组特点
• 3.2 猪细小病毒的非结构蛋白
• 3.3 猪细小病毒的结构蛋白
• 3.4 猪细小病毒基因表达的调控
• 3.4.1 转录水平的调控
• 3.4.2 转录后水平的调控
• 4 猪细小病毒诊断方法的研究
• 4.1 病毒的分离培养
• 4.2 病毒的鉴定
• 4.3 血清学检测
• 4.3.1 血凝及血凝抑制试验
• 4.3.2 血清中和试验
• 4.3.3 乳胶凝集试验
• 4.3.4 斑点免疫金染色法
• 4.3.5 酶联免疫吸附试验
• 4.3.6 银加强胶体金技术
• 4.4 分子生物学诊断
• 4.4.1 聚合酶链反应
• 4.4.2 核酸探针技术
• 4.4.3 原位杂交
• 4.4.4 单克隆杭体技术
• 5 猪细小病毒疫苗的研究
• 5.1 弱毒疫苗
• 5.2 猪细小病毒灭活疫苗
• 5.3 新型疫苗
• 5.3.1 基因工程疫苗
• 5.3.2 核酸疫苗
• 6大肠杆菌表达系统
• 6.1 原核表达载体
• 6.2 原核表达产物的后处理
• 7 结语
• 引言
• 试验一 猪细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 猪细小病毒 DNA 的提取
• 1.2.3 猪细小病毒 VP2 基因片段的扩增
• 1.2.4 琼脂糖凝胶的回收
• 1.2.5 目的片段与载体的酶切回收
• 1.2.6 目的片段与载体的连接
• 1.2.7 连接产物的转化
• 1.2.8 重组质粒的提取
• 1.2.9 重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.10 重组质粒的诱导表达
• 1.2.11 目的蛋白的SDS-PAGE
• 1.2.12 目的蛋白的Western-Blot 分析
• 2 结果
• 2.1 猪细小病毒 VP2 基因的PCR扩增
• 2.2 VP2重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 重组质粒 VP2 的诱导表达
• 2.4 VP2 目的蛋白的Western-Blot
• 3 讨论
• 试验二 猪细小病毒NS1基因在大肠杆菌中的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 猪细小病毒 DNA 的提取
• 1.2.3 猪细小病毒 NS1基因片段的扩增
• 1.2.4 琼脂糖凝胶的回收
• 1.2.5 目的片段与载体的酶切回收
• 1.2.6 目的片段与载体的连接
• 1.2.7 连接产物的转化
• 1.2.8 重组质粒的提取
• 1.2.9 重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.10 重组质粒的诱导表达
• 1.2.11 目的蛋白的SDS-PAGE
• 1.2.12 目的蛋白的Western-Blot 分析
• 2 结果
• 2.1 猪细小病毒 NS1 基因的PCR扩增结果
• 2.2 NS1 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 重组质粒 NS1 的诱导表达
• 2.4 NS1 目的蛋白的 Western-blotting
• 3 讨论
• 试验三 猪细小病毒VP2、NS1重组蛋白的处理及纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 VP2、NS1 重组蛋白的大量表达
• 1.2.2 VP2 重组蛋白的变、复性及其纯化
• 1.2.3 NS1菌体蛋白的处理
• 2 结果
• 2.1 猪VP2 表达蛋白的变、复性及纯化分析
• 2.2 NS1重组蛋白的低温诱导表达
• 3 讨论
• 试验四 猪细小病毒 VP2、NS1间接ELISA的初步建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 血清与试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 VP2、NS1 间接ELISA 程序的建立
• 1.2.2 间接ELISA 最佳反应条件的确定
• 1.2.3 血清吸附
• 1.2.4 特异性试验
• 1.2.5 敏感性试验
• 1.2.6 临床样品的初步检测
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA最佳反应条件的确立
• 2.2 特异性试验
• 2.3 敏感性试验
• 2.4 间接ELISA的初步应用
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读学位期间发表录用论文情况