三疣梭子蟹和日本蟳的线粒体DNA序列比较分析及三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的SNP位点筛选

论文摘要

本文利用线粒体DNA序列分析技术分别对三疣梭子蟹和日本蟳不同地理群体的遗传结构进行了分析,同时,对三疣梭子蟹MIH基因进行了SNP位点的筛选。主要研究结果如下:采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体、和我国山东即墨市会场村三个野生群体的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平,结果显示我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16SrRNA基于片段构建的NJ系统树所反应的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于日本蟳的分类关系上,基于16SrRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支;而青蟹属的三种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的2种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。对采自莱州湾和胶州湾的日本蟳 2群体的线粒体16SrRNA和COI基因片段进行了PCR扩增和测序,分别得到长度为519bp和658bp的碱基序列。研究结果显示这2个基因片段在种内的变异都较低,对2个基因同源序列分析表明,在线粒体16SrRNA基因片段中共检测到7个变异位点（包括6个单一变异位点,1个简约信息位点）和7种单倍型;在COI基因中共检测到8个变异位点（包括6个单一变异位点,2个简约信息位点）和7种单倍型。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了两群体间的序列差异和遗传多样性水平,结果显示2个日本蟳野生群体的遗传多样性比较丰富。用MEGA4.0软件构建了NJ和UPMGA系统树,基于16SrRNA基因片段的系统树显示梭子蟹科的4个属聚为两大支:日本蟳不同的单倍型先聚在一起,然后与青蟹属的3种蟹聚为一支;梭子蟹属的三疣梭子蟹、远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起;再与美青蟹属的美洲蓝蟹、巴西蓝蟹等聚为一支。基于COI基因显示日本蟳不同的单倍型先聚在一起,再与其他3种蟳聚为一支;梭子蟹属的远海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后与美青蟹属的2种蟹相聚为一支。该结果与传统分类一致。采用PCR-SSCP技术对三疣梭子蟹的蜕皮抑制激素基因的外显子进行了SNP位点的筛选,根据3个外显子设计了7对特异性引物,引物M1的扩增产物的SSCP电泳条带有多态性,对有多态性的条带进行克隆测序,对照测序峰图,发现1个SNP位点,即G212A,碱基的变化导致了精氨酸→谷氨酰胺的改变,对于蜕皮抑制激素的生物学活性的影响,值得进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1、线粒体DNA 技术研究进展
• 1.1 线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的结构
• 1.2 线粒体DNA 的特点
• 1.3 mtDNA 常用的分类阶元
• 2、蜕皮抑制激素（Molt-inhibing Hormone，MIH）的研究进展
• 2.1 蜕皮抑制激素
• 2.2 MIH 的国内外研究现状
• 2.3 MIH 调控机制的研究方法
• 3、单核苷酸多态性（single mucleotide polymorphism，SNP）研究进展
• 3.1 SNP 及其特点
• 3.2 SNP 的检测及分型方法
• 3.3 SNPs 在水产动物遗传育种中的应用
• 4、本研究的目的及意义
• 第二章 三疣梭子蟹三个野生群体线粒体基因片段的比较分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基因组DNA 的提取与检测
• 1.2.2 PCR 扩增
• 1.2.3 DNA 序列测定
• 1.2.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 线粒体16SrRNA 基因片段序列分析
• 2.2 线粒体COI 基因片段序列分析
• 3 讨论
• 第三章 日本蟳线粒体16SrRNA 和 COI 基因序列比较分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基因组DNA 的提取与检测
• 1.2.2 PCR 扩增
• 1.2.3 DNA 序列测定
• 1.2.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 线粒体16SrRNA 基因片段序列分析
• 2.2 线粒体COI 基因片段序列分析
• 3 讨论
• 第四章 三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因单核苷酸多态性分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品来源
• 1.1.2 主要实验试剂
• 1.1.3 实验主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 三疣梭子蟹基因组DNA 的提取和检测
• 1.2.2 引物设计与合成
• 1.2.3 三疣梭子蟹MIH 基因SNP 位点的筛选
• 1.2.4 单链构象多态性（SSCP）分析
• 1.2.5 PCR 产物的纯化、克隆和测序
• 1.2.6 测序结果的分析及SNP 位点的确定
• 2、结果
• 2.1 基因组DNA 提取情况
• 2.2 PCR 扩增结果
• 2.3 PCR-SSCP 分析结果及SNP 位点分析
• 2.4 测序结果
• 2.5 基因型在30 个个体中的分布情况
• 3、讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表的学术论文