论文摘要
[背景]人类肠道病毒（Human Enterovirus, HEV）属于微小核糖核酸病毒科（Picornavirdae）肠道病毒（Enterovirus）属,是一类在人类肠道繁殖的常见病毒。HEV通常以无症状的隐性感染为主,病人和无症状带毒者为其主要的传染源,主要通过分泌物或排泄物及其污染的物品而经粪-口、日常接触、空气飞沫等途径传播,对易感人群具有高度的感染性,儿童是最敏感的人群,受感染后可获得免疫力。HEV在人体肠道中增殖,但很少引起腹泻等消化道症状,是以消化道为原发灶的全身感染,感染过程中形成病毒血症,在临床上可引起多种疾病,如急性弛缓性麻痹（Acute Flaccid Paralysis, AFP）、脑膜炎或脑炎、心肌炎、急性出血性结膜炎、手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD）、类感冒病症等。近年来,由HEV引起的各种疾病的发生率一直呈明显上升趋势。传统上根据病毒在人或灵长类动物来源细胞上的复制能力,在不同动物种类上的感染性、致病性和抗原差异性,将HEV按血清型分为脊髓灰质类（以下简称脊灰）病毒（Poliovirus, PV1-3型）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）A型（CVA1-22和24型）、柯萨奇病毒B型（CVB 1-6型）、埃可病毒（Echovirus,ECHO 1-7、9、11-27、29-33型）。随着分子生物学技术与生物信息学技术的应用,根据生物学及遗传特性,HEV被重新划分为A、B、C、D共4个基因组,其中HEV-A包括17个基因型,即CVA 2-8、10、12、14、16、肠道病毒71型（EV71）、EV76、EV89-92。HEV病毒的基因组为单股正链RNA,长约7.5kb,起mRNA作用,整个基因组只含有一个开放阅读框架（Open Reading Frame, ORF）,编码多聚蛋白（Polyprotein）,最后产生4个结构蛋白（VP1-VP4）和7个非结构蛋白。结构蛋白中的VP1蛋白是最主要的衣壳蛋白,是HEV与宿主细胞上受体进行识别、结合的主要结构,许多重要的血清型特异性中和位点位于其上；它不但与病毒的抗原性有关,而且位于病毒颗粒表面,处于机体免疫压力下易发生变异而形成不同的流行株。因此,对VP1蛋白核苷酸序列的研究,既可以确定HEV的基因型别,又可以说明病毒核酸之间的相似程度,提示它们之间同源性的大小,从而明确病毒来源及其传播链。HEV-A可以引起AFP、无菌性脑膜炎、HFMD、疱疹性咽峡炎（Herpangina,HA）等多种疾病,其中以HFMD最为常见。而引起HFMD最常见的病原体为EV71和CVA16。山东省是HFMD的高发省份之一,自2007年至今每年都会发生HFMD的流行。本研究通过对近些年分离到的HEV-A山东地方株的基因型进行分析,特别是对HFMD病例标本中分离毒株的VP1蛋白的编码基因进行分析,从分子流行病学角度探索HEV-A与HFMD的关系,为制订HFMD及其HEV感染所致疾病的防治策略提供科学依据。[研究目的]1.了解HEV-A山东地方株的基因型分布,建立HEV-A山东地方株的VP1区基因核苷酸序列数据库；2.分析HEV-A山东地方株主要型别的遗传进化特征；3.探讨HEV-A主要型别与其所致疾病之间的联系,分析遗传变异对其致病性和流行规律的影响,为相关疾病的预防控制提供理论依据。[研究方法]1.对源于1998-2009年AFP监测系统中的病例标本和2007-2010年部分HFMD病例标本,采用细胞培养的方法进行病毒分离,阳性分离物利用HEV组合血清进行中和试验,确定其血清型。2.对病毒分离阳性但中和试验无法定型的毒株,提取核酸并进行VP1基因扩增和序列测定。3.将测得的基因序列进行剪裁、拼接,得到VP1区基因核苷酸序列。利用NCBI提供的BLAST服务器进行序列比对,确定HEV-A山东地方株的基因型别。4.将HEV-A山东地方株与GenBank中检索到的其它国家和地区分离株,采用BioEdit Sequence Alignment Editor software 5.0.9软件,对其VP1区核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性比较。5.采用Mega3.1软件,以相邻连接方法（Neighbor-joining Method）构建VP1区系统发生树,对HEV-A山东地方株进行亲缘进化分析。[主要结果]1.山东省目前分离到10个基因型的HEV-A,分别为CVA4、CVA5、CVA6. CVA10、CVA12、CVA14、CVA16、EV71、EV76和EV90。2.CVA4山东地方株与其原型株VP1区部分基因核苷酸和氨基酸同源性分别为83.8%～85.3%和97%-99.6%,相对于CVA4原型株,主要表现为核苷酸的变异,氨基酸序列存在4个主要变异位点；VP1区部分基因系统发生树显示,CVA4可以划分为A-E 5个基因簇（Cluster）,山东地方株分别位于Cluster C和E。3.CVA6山东地方株与其原型株VP1区部分基因核苷酸和氨基酸同源性分别为81.3%～81.5%和94.4%-95.0%；VP1区部分基因系统发生树显示,CVA6可以划分为A-C 3个Cluster,山东地方株位于Cluster C,并来自同一传播链（Lineage）。4.CVA10山东地方株与其原型株VP1区部分基因核苷酸和氨基酸同源性分别为75.6%-76.8%和90.2%～93.2%；VP1区部分基因系统发生树显示,CVA10可以划分为A-G共7个Cluster,山东地方株分别位于Cluster F和G。5.CVA16山东地方株与其原型株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%-77.1%和91.5%-92.2%；VP1区全基因系统发生树显示,CVA16可以划分为A、B 2个基因型,山东地方株存在B1a和B1b 2个传播链（Lineage）的共循环。6.EV71山东地方株与其原型株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为82.0%-82.9%和94.2%～95.2%,与C4亚型核苷酸同源性最高,为91.8%-93.7%；VP1区全基因系统发生树显示,EV71可以划分为A、B、C 3个基因型；山东地方株均属于其中的C4亚型,所有C4亚型毒株在第249位氨基酸上表现为与C1-C3亚型不同的氨基酸变异（Ⅰ→Ⅴ）。7.2007年临沂市HFMD暴发主要病原为EV71,且位于C4亚型的C4a进化分支；2008～2010年山东省HFMD流行的主要病原体为EV71和CVA16,兼有CVA4、CVA6、CVA10等其它HEV-A的参与。【主要结论】1.EV71和CVA16是山东省HEV-A的优势型别,其它基因型HEV-A也有分布,并在HFMD等疾病的暴发与流行中占有一定的比例。2. HEV-A山东地方株的遗传进化存在一定的方向性和稳定性。相比CVA16,EV71有较快的进化速率,目前分离到的EV71山东地方株均属于同一进化来源（C4a）, CVA16山东地方株存在2个传播链的共循环。3.部分基因型HEV-A山东地方株的遗传进化存在着一定的地域分布特征。HEV-A各基因型在长期共同进化的过程中可能发生型内或型间重组。4.EV71是中国大陆近些年发生HFMD的暴发和流行的主要病原,其结构蛋白VP1区遗传进化较稳定,未发现基因重组。自1998年以来C4a是中国大陆唯一流行的EV71的基因亚型,推测其非结构蛋白编码区发生重组是造成其持续流行的原因之一