高尔基体囊泡转运蛋白P115对胃癌细胞增殖的影响及分子机制的研究

论文摘要

目的1、观察胃癌组织和细胞中P115和MIF表达的情况,探讨其在胃癌发生发展中的意义。2、观察P115对胃癌细胞增殖的影响。3、探索P115影响胃癌细胞增殖的分子机制。方法1、应用RT-PCR、免疫组化S-P法和Western blot检测P115及MIF在正常胃黏膜和胃癌组织,3种细胞株（正常胃黏膜上皮GES-1,不同分化程度的胃癌细胞株MKN-28、BGC-823）中的mRNA和蛋白的表达情况。2、构建P115-shRNA重组载体和人真核P115全长载体pEGFP-N1-P115,并分别转染至高表达P115的胃癌细胞株BGC-823和低表达P115的胃癌细胞株MKN-28。应用荧光显微镜及流式细胞术对转染效果进行评价,Real-time-PCR和western blot检测P115 mRNA和蛋白表达的变化。3、采用MTT实验,流式细胞术研究P115对胃癌细胞BGC-823增殖能力的影响;Real-time-PCR及Western blot检测转染前后增殖相关因子cyclinD1、Mcm2、PCNA的mRNA和蛋白表达水平。4、采用MTT实验,流式细胞术研究P115对胃癌细胞MKN-28增殖能力的影响;Real-time-PCR及Western blot检测转染前后增殖相关因子cyclinD1、Mcm2、PCNA的mRNA和蛋白表达水平。5、采用免疫共沉淀技术检测BGC-823、MKN-28胃癌细胞株中P115和MIF之间的相互作用;采用Real-time-PCR、Western blot、ELISA法分别检测转染细胞系中MIF的mRNA和蛋白表达水平及分泌水平;并采用Western blot检测pERK1/2的表达水平。结果1、P115和MIF在胃癌组织和细胞中表达升高P115和MIF在胃癌组织中的阳性表达率分别为73.3%、80%,在正常胃黏膜组织中的阳性表达率分别为40%、46.7%,胃癌组织中P115和MIF的表达明显高于正常胃黏膜组织（P <0.01 ） ,且P115的表达和MIF的表达呈正相关（r =0.433）;胃癌组织中P115、MIF的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常胃黏膜组织（P <0.01）。RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot结果显示: P115、MIF在胃癌细胞株MKN-28、BGC-823中的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常胃黏膜上皮GES-1（P <0.01）;且低分化胃癌细胞株BGC-823中P115和MIF的表达水平明显高于高分化胃癌细胞株MKN-28（P <0.05）。2、P115特异性shRNA可以降低胃癌细胞BGC-823的增殖能力经测序证实,重组质粒P115-shRNA构建成功。构建获得的P115-shRNA表达载体均能抑制P115基因的表达,其中以P115-shRNA2的抑制效果最强,其对P115mRNA表达的抑制率为76.8%,对蛋白表达的抑制率为70.97%;MTT结果显示P115-shRNA2组细胞较未处理的BGC-823细胞增殖能力明显降低;流式细胞分析结果表明P115-shRNA2组细胞生长停滞于G1期;且与未处理的BGC-823细胞相比,P115-shRNA2组细胞中cyclinD1、mcm2、PCNA的mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。3、P115外源性高表达于胃癌细胞株MKN-28可以促进其增殖经测序证实,重组质粒pEGFP-N1-P115构建成功。与未处理的MKN-28相比,pEGFP-N1-P115组细胞中P115的mRNA和蛋白表达水平显著增加（P<0.01）;MTT结果显示pEGFP-N1-P115组细胞较未处理的MKN-28细胞增殖能力明显增加;流式细胞分析结果表明pEGFP-N1-P115组较未处理的MKN-28细胞S期的分布增加了13.71%;且与未处理的MKN-28相比, pEGFP-N1-P115组细胞中cyclinD1、mcm2、PCNA的mRNA及蛋白表达水平明显增加（P<0.01）。4、P115上调MIF的表达和分泌,并上调ERK1/2的磷酸化水平在抗体沉淀的MIF相互作用的蛋白复合物中,可以检测到P115的存在;与未处理的BGC-823细胞相比,P115-shRNA2组细胞中MIF的mRNA和蛋白表达水平显著降低,其培养上清中MIF的含量明显降低（P<0.01）, pERK1/2的蛋白表达水平显著降低（P<0.01）;与未处理的MKN-28细胞相比,pEGFP-N1-P115组细胞中P115的mRNA和蛋白表达水平显著增加,其培养上清中MIF的含量明显增高（P<0.01）,pERK1/2的蛋白表达水平显著增加（P<0.01）。结论P115在胃癌组织和细胞中高表达;P115对胃癌细胞的生长具有促进作用;P115促进胃癌细胞增殖的作用至少部分是通过上调MIF的表达和分泌,从而调节ERK信号传导途径实现的;P115可作为研究胃癌发生发展分子机理的新靶点。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 探讨P115 、MIF 在胃癌组织和细胞中的表达及意义
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 探讨P115 对胃癌细胞增殖的影响
• 第一节 P1155hRNA 表达载体的构建和鉴定及其对胃癌细胞BGC-823 增殖的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 第二节 P115 全长表达载体对胃癌细胞MKN-28 增殖的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 P115 影响胃癌细胞增殖的机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 1 结论
• 2 创新点和特色
• 3 存在问题与展望
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表文章