人胎儿胰岛样细胞团源胰腺干细胞分离和鉴定

论文摘要

糖尿病作为严重危害人类健康的三大主要疾病之一,传统的药物及胰岛素替代疗法不能从根本上医治该病。近年来,随着成人胰岛移植的成功和对免疫抑制方案的改进,移植胰岛细胞已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途径。但是,由于每个临床胰岛移植受体通常需要2～4个新鲜尸体胰腺,胰岛供体短缺的矛盾阻碍了胰岛细胞治疗糖尿病技术的推广和应用。胰腺干细胞（Pancreatic stem cells）是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞,能自我更新,具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞。体外分离、克隆人类胰腺干细胞作为种子细胞,并定向诱导其分化为功能性胰岛细胞移植治疗糖尿病,是解决胰岛供体短缺的有效途径。本试验从人胎儿胰腺分离胰岛样细胞团（Islet-like cell clusters, ICCs）,从中纯化出干细胞并进行扩增培养,对其表达特性及诱导分化等方面进行研究,从而优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞,为人胎儿胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。本实验无菌取3-5月龄人胎儿胰腺,剪碎后用Ⅳ型胶原酶消化,RPMI1640+10%NBS培养获得胰岛样细胞团;挑出细胞团接种于明胶包被的玻璃皿中,低糖DMEM +10%NBS+10ng/mL EGF进行贴壁培养,当细胞长成单层后传代,以RPMI1640+10%NBS培养;传代4d后可见许多呈克隆样生长的上皮样细胞片,挑出用RPMI1640 +10%NBS扩增培养,获得纯化的上皮样细胞,现传45代,每代冻存106-108个细胞。随机取生长状态良好的第13代细胞,接种到96孔板中,采用MTT法测定并绘制细胞生长曲线。生长曲线显示,用20%血清培养时,其传代第三天进入对数生长期,第五天达到平台期,在10%血清的培养液中生长则相对较慢。将第6代、11代、21代细胞分别接种于96孔板中,培养三天后4%多聚甲醛（pH7.4）固定后进行免疫组织化学染色。细胞表达PDX-1、CK-19、PCNA、CK-7、CK-3、E-钙粘素、Nestin、Glucagon、Glut2、Vimentin、;不表达Insulin、Somatostatin、IAPP（Islet amyloid polypeptide）。提取第39代细胞总RNA进行RT-PCR分析,细胞也表达PDX-1,CK-7,CK-19,Nestin,胰高血糖素,β-半乳糖苷酶,Vimentin,Glut2,不表达NGN3,胰岛素,生长抑素,胰多肽,葡萄糖激酶等。悬浮培养时CK-19表达仍然比较强,但nestin表达明显减弱。将培养的第5代细胞上流式细胞仪检测,细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。第39代细胞仍稳定表达CD29、CD44、CD166;稳定不表达CD54、CD90、CD11a。而CD14、CD34、CD45、CD105、CD117、CD 71、CD34、CD45的表达不稳定。将第39代HFIECs用10μg/L 10mmol/NIC, 10μg/L bFGF, 10μg/L HGF诱导培养14d,可形成DTZ阳性的细胞团。胰岛素释放量在第20d达到最大,证明诱导细胞在20d成熟程度达到最高。本试验表明从人胎儿胰腺分离培养的胰岛样细胞团中能纯化出具有自我更新能力的上皮样细胞,其来源于胰腺导管,具胰腺干细胞特性。该细胞有望成为研究治疗糖尿病的种子细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 引言
• 第一章 胰腺的发育
• 1.1 胰腺的大体发育
• 1.2 胰腺的分子发育
• 1.2.1 胰腺的决定
• 1.2.2 内分泌的决定
• 1.2.3 内分泌祖细胞的分化定向
• 1.2.4 胰岛各型细胞的维持
• 第二章 胰腺干细胞研究进展
• 2.1 胰腺干细胞的概念
• 2.2 胰腺干细胞的来源
• 2.2.1 胚胎干细胞
• 2.2.2 成体胰腺
• 2.2.3 横向分化
• 2.3 胰腺干细胞的分离培养
• 2.3.1 胰腺导管上皮细胞分离与培养
• 2.3.2 胰岛源细胞分离与培养
• 2.3.3 胰干细胞单克隆培养
• 2.3.4 流式细胞仪分离
• 2.3.5 免疫磁珠分离
• 2.4 胰腺干细胞的分子标志
• 2.4.1 胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）
• 2.4.2 角蛋白（CK-19）
• 2.4.3 神经元素 3（Ngn3）
• 2.4.4 巢蛋白（Nestin）
• 2.4.5 ISL1
• 2.4.6 NKX2.2,NKX6.1
• 2.4.7 PAX4,PAX6
• 2.4.8 NeuroD
• 2.4.9 c-met
• 2.4.10 CXCR4
• 2.4.11 SOX9
• 2.4.12 C-kit
• 2.4.13 GLUT2
• 2.4.14 酪氨酸羟化酶
• 2.4.15 波形蛋白
• 2.5 胰腺干细胞的诱导分化
• 2.5.1 培养基
• 2.5.2 诱导因子及其作用
• 2.5.3 葡萄糖
• 2.5.4 细胞外基质（ EMC）
• 2.5.5 基因工程技术诱导或抑制操纵基因的表达
• 2.5.6 血管的诱导作用
• 第三章 人胎儿胰腺干细胞研究进展
• 3.1 人胎儿 ICCs 的分离与培养
• 3.1.1 分离与培养方法
• 3.1.2 影响分离培养的因素（ICCs 获得量）
• 3.1.3 扩增
• 3.2 人胎儿胰腺细胞的 ICCs 表达特性
• 3.3 人胎儿 ICCs 诱导分化
• 3.4 人胎儿胰腺干细胞研究现状
• 试验研究
• 第四章 人胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离与培养
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 人胎儿 ICCs 源干细胞的分离与培养
• 4.2.2 不同血清浓度对 HFIECs 生长的影响
• 4.2.3 冷冻对细胞存活率的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 取材
• 4.3.2 人胎儿 ICCs 的分离培养
• 4.3.3 ICCs 中上皮样细胞纯化与扩增
• 4.3.4 冷冻对的细胞影响
• 4.4 小结
• 第五章 人胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞的鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂与仪器
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 免疫组织化学染色鉴定结果
• 5.2.2 RT-PCR 检测结果
• 5.2.3 流式细胞仪鉴定结果
• 5.2.4 体外诱导
• 5.2.5 体内移植
• 5.3 讨论
• 5.3.1 细胞表达干细胞分子标志
• 5.3.2 流式细胞仪检测细胞表面标志表达
• 5.3.3 体外诱导
• 5.3.4 体内移植
• 5.4 小结
• 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 主要缩略词简表
• 致谢
• 作者简介