构建转基因细胞模型筛选小球藻糖蛋白预防肿瘤作用的研究

论文摘要

本文在国内首次报道了从小球藻中提取的一种糖蛋白具有预防肿瘤作用。首先通过热水浸提、脱蛋白、醇析等步骤从小球藻中分离出一种糖蛋白,并对提取工艺中的料水比、温度、提取时间、提取次数等单因素进行优化以达到最佳提取效果。其次机体内的Ⅱ相酶在防治肿瘤发生过程中起着非常重要的作用,Ⅱ相酶基因启动区有一保守的DNA基序被称为抗氧化反应元件（ARE）,可调控下游相关基因表达。据此原理,以TK为基本启动子,将人工合成的ARE与绿色荧光蛋白（GFP）基因相串联,构建ARE调控的报告载体pARE-TK- GFP/neo和对照载体pTK-GFP/neo。分别转染HepG2细胞用G418筛选出阳性克隆。然后在阳性细胞中加入小球藻糖蛋白溶液,作用48h后检测细胞的相对荧光强度,从而表明其对肿瘤的化学预防效果。具体研究内容及结果如下:1.对小球藻糖蛋白提取工艺中的各单因素进行正交实验,确定了小球藻糖蛋白的最佳提取条件为:料水比1:20,在温度70℃下提取2次,每次6h。在此条件下糖组分得率最高。对所提取的糖蛋白进行凝胶柱层析鉴定和SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明其为电泳纯单一糖蛋白,据蛋白质标准曲线可得出该糖蛋白分子量约为63.7KDa。2.应用重组PCR技术,从pRL-TK上扩增重组TK启动子,并在其基本启动子上游创建特异性酶切位点Sac I。第一轮PCR获得500 bp和150 bp两个片段,第二轮PCR获得635 bp的重组TK启动子,经电泳初步鉴定正确后克隆入pMD18-T载体中又经酶切鉴定正确。扩增后的重组TK启动子克隆入pEGFP中构建载体pTK-GFP,并在其上游插入ARE片段构建pARE-TK-GFP,两者均经PCR鉴定正确。最后从以上两载体中分别扩增TK和ARE-TK目的片段克隆入载体pEGFP-N1中,构建最终表达载体pTK-GFP/neo和pARE-TK-GFP/neo,酶切和测序鉴定结果表明目的片段插入位置正确且无突变。3.两表达载体分别用脂质体法转染HepG2细胞后,用800μg/ml G418筛选出阳性细胞克隆HepG2-TK-GFP和HepG2-ARE-TK-GFP,在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。阳性克隆细胞经扩大培养后加入不同浓度梯度的糖蛋白溶液,同时用已知化学预防剂PDTC和香菇多糖作对照。结果显示:糖蛋白在200μg/ml时诱导效果最好,且糖蛋白浓度与GFP相对荧光度间存在剂量效应关系,而在对照细胞中未发现与受试物有剂量效应关系。本实验构建了一个可用于体外快速筛选诱导Ⅱ相酶化合物的转基因细胞模型,为各种天然或人工合成具有预防肿瘤作用化合物的筛选奠定了基础,同时也可为小球藻糖蛋白作为肿瘤预防剂的开发提供了初步的实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1 小球藻研究概况
• 1.1 小球藻的保健药理作用
• 1.1.1 促进免疫力
• 1.1.2 抗肿瘤
• 1.1.3 抗病原微生物
• 1.1.4 抗辐射作用
• 1.1.5 降血脂和抗动脉粥样硬化活性
• 1.1.6 其他作用
• 1.2 小球藻糖蛋白研究进展
• 2 报告基因的选择
• 2.1 绿色荧光蛋白的性质
• 2.2 绿色荧光蛋白的优点
• 3 化学预防剂的研究进展
• 3.1 Ⅱ相酶的概念
• 3.2 化学预防剂的筛选
• 4 本研究的目的和意义
• 第一章 小球藻糖蛋白的分离纯化
• 1 实验材料
• 1.1 小球藻来源
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 糖和蛋白质含量的测定
• 2.2 糖蛋白粗提的工艺流程
• 2.3 糖蛋白提取工艺参数的单因素实验
• 2.4 糖蛋白的纯化
• 2.5 凝胶柱层析鉴定
• 2.6 SDS-PAGE 电泳鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 糖蛋白提取工艺参数的比较
• 3.1.1 料水比对糖蛋白得率的影响
• 3.1.2 温度对糖蛋白得率的影响
• 3.1.3 提取时间对糖蛋白得率的影响
• 3.1.4 提取次数对糖蛋白得率的影响
• 3.1.5 优化小球藻糖蛋白提取工艺的正交实验
• 3.2 糖蛋白的提纯与分析
• 3.2.1 纯化
• 3.2.2 柱层析鉴定
• 3.2.3 PAGE 电泳鉴定
• 4 讨论
• 第二章 绿色荧光蛋白真核表达载体的构建
• 1 实验材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 启动子的选择与克隆
• 2.1.1 PCR 引物的设计与合成
• 2.1.2 第一轮PCR 反应
• 2.1.3 第二轮PCR 反应
• 2.1.4 TA 克隆
• 2.2 绿色荧光蛋白（GFP）表达载体的构建
• 2.2.1 ARE 的设计、退火和磷酸化
• 2.2.2 pTK-GFP 载体的构建
• 2.2.3 pARE-TK-GFP 载体的构建
• 2.2.4 pTK-GFP/neo 真核表达载体的构建
• 2.2.5 pARE-TK-GFP/neo 真核表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 重组TK 启动子的扩增
• 3.2 TA 克隆的酶切鉴定
• 3.3 pTK-GFP 和pARE-TK-GFP 表达载体的鉴定
• 3.4 pTK-GFP/neo 和pARE-TK-GFP/neo 真核表达载体的鉴定
• 3.4.1 酶切鉴定
• 3.4.2 测序鉴定
• 4 讨论
• 第三章 转基因细胞模型的建立及对糖蛋白的筛选
• 1 实验材料
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 HepG2 细胞的培养
• 2.2 转染用质粒的制备
• 2.2.1 pTK-GFP/neo 和pARE-TK-GFP/neo 表达载体的大量提取
• 2.2.2 聚乙二醇法纯化
• 2.2.3 表达载体的浓度测定
• 2.3 脂质体法转染 HepG2细胞
• 2.4 阳性克隆的筛选
• 2.5 转基因细胞中 GFP 荧光与DNA 含量的检测
• 2.6 转基因细胞模型对糖蛋白的筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因细胞模型的建立
• 3.2 报告基因表达体系对人工合成PDTC 的实验研究
• 3.3 报告基因表达体系对天然化学物香菇多糖的实验研究
• 3.4 报告基因表达体系对糖蛋白的实验研究
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录