人卵母细胞第一极体活检及荧光原位杂交对非整倍体诊断的研究

论文摘要

第一部分小鼠第一极体的活检目的利用细胞松弛素B(CB)对小鼠卵母细胞预处理,建立鼠卵单精子卵胞浆内注射(ICSI)并第一极体活检的模型。研究活检极体对卵母细胞受精及胚胎发育的影响,为人卵母细胞第一极体活检做理论和技术准备。方法以昆明品系性成熟小鼠为实验材料,设定活检组和对照组。再按是否予CB对鼠卵预处理,分为CB组和无CB组。将获取的成熟卵母细胞行ICSI。活检组采用激光切割透明带活检出第一极体,培养小鼠胚胎至囊胚期。对照组在ICSI术后直接培养至囊胚期。观察并比较两组的受精率、卵裂率和囊胚形成率。结果激光法活检小鼠卵母细胞第一极体成功率9O%。无CB预处理时,小鼠卵母细胞死亡率高。存活的鼠卵中,第一极体活检组和对照组之间受精率、卵裂率、桑椹胚及囊胚形成率无统计学差别(P＞0.05)。CB处理时,小鼠卵母细胞死亡减低。存活的鼠卵中,第一极体活检组和对照组之间受精率、卵裂率、桑椹胚及囊胚形成率亦无统计学差别(P＞0.05)。CB处理后小鼠卵母细胞ICSI后的存活率显著提高(P＜0.01),存活鼠卵受精率增高,具有统计学差异(P＜0.05)。结论1.本实验建立了小鼠卵母细胞第一极体活检的模型,并且发现利用细胞松弛素B预处理更利于此动物模型的建立;2.激光打孔活检小鼠第一极体安全有效;3.小鼠第一极体的活检对卵母细胞的受精及胚胎后续发育无不良影响。第二部分人卵母细胞第一极体活检目的探索人卵母细胞第一极体活检的方法:评估第一极体活检对胚胎后续发育的影响,比较不同形态级别极体活检对胚胎发育的影响。方法利用废弃的卵母细胞行ICSI术,后行激光切割透明带法活检第一极体,观察活检后卵母细胞受精及胚胎后续发育情况。同时,和仅行ICSI组的对照组比较,观察两组双原核率、卵裂率及囊胚形成率有无差别。按形态对第一极体进行分级,比较不同形态的极体活检对胚胎后续发育的影响。结果激光打孔法活检人卵母细胞第一极体成功率95.3%。活检组和对照组在两原核(2PN)形成率、卵裂率及囊胚形成率上均无统计学差异(P＞0.05)。不同形态第一极体的卵母细胞2PN形成率、卵裂率无差别(P＞0.05),囊胚形成率有统计学差异(P＜0.05)。活检组和对照组对应形态级别第一极体的卵母细胞相比较,2PN形成率、卵裂率及囊胚形成率无显著性差异(P＞0.05)。结论1.激光打孔法活检极体安全有效;2.第一极体活检不会对人卵母细胞受精及胚胎发育造成不良影响;3.不同形态级别极体的活检不会影响胚胎后续的发育情况。第三部分人卵母细胞第一极体荧光原位杂交对非整倍体诊断的研究目的:利用荧光原位杂交(FISH)技术,对活检的新鲜卵母细胞第一极体染色体进行检测,间接推知卵母细胞非整倍体形成情况。方法:第一极体进行低渗处理、利用甲醇/冰醋酸法(Carnoy液)固定。后进行FISH,经过变性、杂交、洗片后在荧光显微镜下观察染色体信号并经图象采集系统分析,判断卵母细胞21号染色体非整倍体发生率。同时中期相外周血淋巴细胞FISH作对照。结果:74枚第一极体中,成功固定69枚,固定成功率93.2%。69枚第一极体行FISH,其中54枚出现可分析的杂交信号,杂交成功率78.3%。其中少一条染色单体极体4枚,多一对染色体的极体1枚,姐妹染色单体提前平衡分离11枚。对照组淋巴细胞的杂交成功率97.3%。结论:1.初步建立了人卵母细胞第一极体FISH对非整倍体诊断的方法;2.21号染色体非整倍体中,姐妹染色单体过早不平衡分离(PSSC)发生率较二价体不分离(ND)高。姐妹染色单体平衡分离现象出现于新鲜卵母细胞第一极体中,机制需进一步研究。

论文目录

• 中英文缩略词对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 小鼠第一极体活检
• 1 前言
• 2 材料与仪器
• 3 实验方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第二部分 人卵母细胞第一极体活检
• 1 前言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第三部分 人卵母细胞第一极体荧光原位杂交对非整倍体诊断的研究
• 1 前言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附图:第一极体FISH图片
• 附录
• 致谢
• 综述: 极体活检在植入前遗传学诊断中的应用
• 参考文献