论文摘要
研究背景及目的急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia, AML）是一组具有不同生物学特性的恶性血液肿瘤。近年来,随着分子遗传学研究的进展,大多数AML可以检出基因水平的异常。FLT3基因在造血干／祖细胞和前体B细胞等增殖及分化中具有重要的作用。FLT3基因发生突变,导致造血细胞的增殖、分化及凋亡异常,引起白血病的发生。NPM1基因所编码的核仁磷酸蛋白（nucleophosmin, NPM、NO38、B23或NPM1蛋白）主要表达于核仁,可以穿梭于核仁和胞浆之间,参与核糖体前体的运输和合成、中心体的复制、染色体组的维持稳定及DNA聚合酶a活性的调节,进而调控细胞的周期进程和增殖发育。此外,NPM1蛋白和P53、P19蛋白相互作用,起着重要的抑制肿瘤作用。NPM1基因突变可导致其移位至胞浆,使核仁内的抑癌蛋白（alternate-reading-frame protein, Arf）失活,通过依赖或非依赖p53途径促进白血病细胞恶性增殖。C-KIT基因编码分子量145kD的跨膜酪氨酸激酶受体,其配体为干细胞因子（stem cell factor, SCF）, SCF是重要的造血生长因子之一,与其它的细胞因子协同作用促进造血干细胞的增殖分化。C-KIT基因突变导致了C-KIT不依赖配体的自发性受体二聚体化,引起C-KIT受体的持续激活,致使造血细胞过度增殖或凋亡受抑,引起白血病发生。2011年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）已将FLT3基因、NPM1基因和C-KIT基因突变作为AML危险分层中的重要分子遗传学标志,认为基因突变与AML发生、发展、预后及疗效密切相关。本课题通过提取贮存骨髓涂片DNA的方法,对AML的FLT3基因、NPM1基因及C-KIT基因突变进行分析,探讨这三种基因突变与AML临床特征之间的关系,为AML的临床分层、预后判断、微小残留病灶的检测及分子靶向治疗等提供更多的科学实验和理论依据。方法1.采用改良的苯酚：氯仿：异戊醇法提取贮存骨髓涂片的DNA。2.采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术和琼脂糖凝胶电泳方法对55例AML患者进行FLT3内部串联重复（internal tandem duplication, ITD）突变的检测。3.采用PCR、DNA测序和分子克隆方法对55例AML患者进行NPM1基因突变的检测及分析。4.采用PCR、DNA测序和分子克隆方法对55例AML患者进行C-KIT基因突变的检测及分析。结果55例-20℃低温冻存的未经瑞氏染色的骨髓涂片和10例室温保存的瑞氏染色的骨髓涂片均可以用改良的苯酚：氯仿：异戊醇法成功提取DNA,并且提取到的DNA可用于PCR、直接测序及分子克隆测序分析。在55例AML患者中,检测出10例FLT3-ITD阳性（突变型）患者,其中9例为杂合型突变和1例为纯合突变,阳性率为18.2%;FLT3-ITD阳性患者以M5居多,但在FAB亚型中的分布差异无统计学意义（P>0.05）；FLT3-ITD阳性组较阴性组初次诱导缓解治疗完全缓解（complete remission,CR）率低、无事件生存（event-free survival,EFS）时间和总生存（overall survival rate,OS）时间短,两组三个指标之间差异有统计学意义（P<0.05）。55例AML患者经PCR扩增后反向直接测序和克隆测序,检出9例为NPM1基因杂合突变型,突变率为16.4%,全部为A型突变,即在第960～961位核苷酸之间插入TCTG（反向互补为CAGA）;NPM1基因突变在本实验中仅见于M2和M5；NPM1基因突变组较野生组初诊时外周血白细胞计数及骨髓原始细胞比例高（P<0.05）,但性别、年龄、血红蛋白、血小板、乳酸脱氢酶及初次诱导缓解治疗CR率差异均无统计学意义（P>0.05）；10个月以内NPM1突变组比野生组EFS率高,19个月内的NPM1突变组比野生组OS率高（P<0.05）；9例NPM1突变患者同时伴有3例FLT3-ITD阳性,对NPM1+/FLT3-ITD+.NPM1+/FLT3-ITD-、NPM1+/FLT3-ITD+和NPM1+/FLT3-ITD-四组初诊时外周血白细胞数进行比较,结果为：NPM1+/FLT3-ITD+>NPM1+/FLT3-ITD->NPM1-/FLT3-ITD+>NPM1-/FLT3-ITD-（P<0.05）;四组初次诱导缓解治疗CR率由高到低依次为NPM1+ /FLT3-ITD->NPM1-/FLT3-ITD->NPM1-/FLT3-ITD+>NPM1+/FLT3-ITD+（P<0.05）:四组骨髓原始细胞比例及乳酸脱氢酶差异无统计学意义（P>0.05）；用Cox回归综合评价6个预后因素包括年龄、骨髓原始细胞比例、NPM1+/FLT3-ITD+.NPM1+ /FLT3-ITD-、NPM1-/FLT3-ITD+及NPM1-/FLT3-ITD-对AML生存期的影响,结果提示NPM1-/FLT3-ITD+（P=0.005,RR=1.250）是影响OS的危险因素。55例患者标本用第17号外显子扩增C-KIT基因进行正向测序后发现2例为C-KIT基因突变型（3.6%）,本实验中仅见于M2a和M3,分别为D816H突变型和D816V突变型；Logistic回归评价各影响因素与AML患者初次诱导缓解治疗达CR的关系显示,FLT3-ITD突变OR值为66.940,说明FLT3-ITD突变为危险因素；C-KIT基因突变患者与FLT3-ITD阳性及NPM1突变型患者没有发现重叠。结论1.改良苯酚：氯仿：异戊醇法提取骨髓涂片DNA较为成功,适用于低温冻存未经瑞氏染色及室温保存瑞氏染色的骨髓涂片,并且提取到的DNA可用于PCR、直接测序及分子克隆测序分析。2.FLT3-ITD突变在AML患者中发生频率较高；FLT3-ITD阳性患者初次诱导缓解治疗CR率低,EFS和OS时间短,提示FLT3-ITD突变为预后不良的分子标志。3.NPM1基因突变与FLT3-ITD突变发生几率相近；NPM1基因A型突变类型较常见；NPM1突变组具有高白细胞数、高骨髓原始细胞比例的临床特点；10个月内NPM1突变组EFS率高,19个月内NPM1突变组OS率高,提示NPM1基因突变可能是较好的预后因素。4.本实验发现3例患者同时具有NPM1基因和FLT3-ITD基因突变；两基因的4种组合初次诱导缓解治疗CR率最高的为NPM1+/FLT3-ITD-组,最低的为NPM1+/FLT3-ITD+组。用Cox回归分析结果为NPM1-/FLT3-ITD+是影响OS时间的危险因素。5.C-KIT基因突变在AML中发生率低,C-KIT基因未见与FLT3基因、NPM1基因重叠突变。6.用Logistic回归分析提示FLT3-ITD突变是影响AML患者初次诱导缓解治疗达CR的危险因素,NPM1基因突变和C-KIT基因突变不影响CR率。
论文目录
相关论文文献
标签：骨髓涂片论文; 基因论文; 急性髓细胞白血病论文; 基因突变论文; 预后论文;