胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2及其编码的C5基因的分子鉴定

论文摘要

双生病毒是一类世界范围内广泛发生的具有孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒，近年来，已在全球范围内广泛发生并引起了严重病害。我国在云南、广西、海南、广东和台湾等地相继发现有双生病毒的病害，但在同属华南地带的福建省却从未有过报道。本论文对福建福州金山地区烟草地中的发病烟草植株进行了病原鉴定，证实该病害是由双生病毒引起，并对F2分离物进行了全长基因组的克隆及测序。结果表明F2 DNA-A全长2754个核苷酸（登录号EF527823）。全序列比对之后发现F2 DNA-A与新加坡胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein virus，AYVV，登录号X74516）的同源性最高，说明F2是胜红蓟黄脉病毒的一个分离物，并将F2分离物命名为胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物（Ageratum yellow vein virus-F2，AYVV-F2）。利用国际上的通用引物对F2进一步进行PCR检测，发现F2很可能不含有DNA-B组分而由一个卫星小分子DNA-β伴随。测序结果证实F2 DNA-β全长1345个核苷酸（登录号EF527824）。在对F2 DNA-A序列进行分析后发现，DNA-A共编码7个开放读码框架（ORFs），除了病毒链编码V1（CP）和V22个ORFs以及互补链编码C1（Rep）、C2、C3和C4 4个ORFs之外，还发现在其互补链上编码了一个C5 ORF，它与V1 ORF以及V2 ORF重叠，并且具有典型的起始密码子ATG和终止密码子TAA，大小为297 bp，编码一个由98个氨基酸残基组成的多肽。而F2 DNA-β组分仅在互补链上编码了一个βC1 ORF。为了证实C5 ORF在植物实体中是否有可能转录及表达，运用瞬时表达的方法对F2 C5 ORF上游的512 bp部分启动子序列C5P进行了启动子活性鉴定。组织化学染色结果证明C5P具有启动子活性，能够启动pCAMBIA载体上后续gusA基因在烟草中进行表达，表明C5P同样也能够驱动C5 ORF在植物实体中进行转录与表达。利用多个在线软件对C5基因及其编码的蛋白质进行了一系列的分析和预测，结果表明C5基因无论是核苷酸序列还是氨基酸序列均很保守。此外，C5蛋白中含有多个潜在的基序，在N端发现一个双生病毒AC4／5保守功能区，在该保守区前端还编码了一段信号肽序列，可能是与细胞线粒体定位有关，序列中段与C端存在两个固有无规区及一个低复杂度区域。此外，对C5蛋白进行基序分析的结果表明，C5蛋白在多个位置含有潜在的修饰位点，这些位点可能与蛋白的激活有关。对C5蛋白的蛋白质二级结构进行预测的结果表明C5蛋白质的二级结构比较简单。通过上述生物信息学的分析，推测C5蛋白在其蛋白前体翻译完成之后需要进行进一步的修饰、转运和切割之后才能转变成为有活性的蛋白质，另外其活性很可能与细胞间的信号转导过程相关联。为了方便下一步从蛋白质水平展开对植物实体中C5蛋白的研究，将C5基因在体外进行诱导表达，并获得6×His-F2 C5融合蛋白。然后对6×His-F2 C5融合蛋白制备了抗血清。为后续对该蛋白在病株组织切片中进行免疫定位研究打下了坚实的基础。另外通过粉虱传毒实验证实F2分离物的寄主范围大致包含茄科（Solanaceae）、菊科（Compositae）、大戟科（Euphorbiaceae）及酢浆草科（Oxalidaceae）等植物，同时发现F2基因组中很可能并不含有AYVV DNA-β，而只存在ToLCV-β。因此推测F2是由AYVV在传播及致病过程中与ToLCV复合侵染某一寄主植物之后发生重组而形成的重组病毒。近年来，一些参与病毒侵染和复制的调控因子陆续被发现及鉴定。基于目前国际上对AC5／C5蛋白的功能分析结果，大致可判定AC5／C5蛋白很可能是双生病毒编码的一个重要蛋白，在病毒生活周期的特定的过程扮演着一个关键的角色。因此，鉴定AC5／C5蛋白的功能并弄清该蛋白与病毒本身编码蛋白或寄主因子之间的互作能力，对于弄清双生病毒的复制和致病机理具有重要意义，为阐明双生病毒调控植物细胞周期的机理提供帮助，也可望为防治双生病毒病提供新的思路。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 研究背景
• 1 双生病毒概述
• 1.1 双生病毒的分类
• 1.2 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的基因组结构及功能
• 1.3 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒的复制与转录
• 1.4 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒伴随的小分子DNA
• 1.5 双生病毒的进化
• 2 启动子概述
• 2.1 核心启动子
• 2.2 转录因子结合区
• 2.3 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒启动子研究进展
• 3 AC5/C5蛋白的研究进展
• 4 立题依据
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 毒源
• 1.2 供试昆虫及植物寄主及免疫用家兔
• 1.3 菌株和质粒
• 1.4 试剂
• 1.5 引物设计及序列
• 1.6 常用缓冲液的配制
• 2 方法
• 2.1 CTAB法提取植物总DNA
• 2.2 PCR技术
• 2.2.1 普通PCR反应
• 2.2.2 高保真PCR反应
• 2.3 PCR产物纯化
• 2.4 DNA克隆技术
• 2.4.1 连接反应
• 2.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.4.3 大肠杆菌感受态细胞转化
• 2.4.4 重组质粒的提取与鉴定
• 2.5 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 2.5.1 诱导表达
• 2.5.2 SDS-PAGE
• 2.6 多克隆抗体制备
• 2.7 融合蛋白抗血清的效价测定
• 2.8 根癌农杆菌感受态细胞制备
• 2.9 根癌农杆菌感受态细胞转化
• 2.10 植物表达载体在烟草中的瞬时表达
• 2.10.1 农杆菌制备
• 2.10.2 浸润
• 2.10.3 组织化学染色及细胞脱色
• 2.10 由粉虱介导的供试植株的传毒实验
• 2.11 DNA序列测定及分析
• 第三章 胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2的发现与鉴定
• 1 结果与分析
• 1.1 田间病毒分离物的分子检测
• 1.2 F2是胜红蓟黄脉病毒在福建烟草上的一个分离物
• 1.3 F2的病毒基因组结构
• 2 讨论
• 第四章 F2分离物C5基因启动子的活性鉴定
• 1 结果与分析
• 1.1 C5启动子的序列分析
• 1.2 C5P部分启动子序列的PCR扩增与克隆
• 1.3 以C5P为启动子的植物表达载体的构建
• 1.4 以C5P为启动子的植物表达载体在烟草中的瞬时表达
• 1.5 GUS活性的组织化学染色
• 2 讨论
• 第五章 F2 C5基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备
• 1 结果与分析
• 1.1 F2 C5基因的克隆
• 1.2 原核表达载体pET-29a-C5的构建
• 1.3 目的蛋白的诱导表达与抗体的制备
• 1.4 融合蛋白制备抗血清的效价测定
• 1.5 目的蛋白的生物信息学分析
• 2 讨论
• 第六章 胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2的粉虱传毒实验
• 1 结果与分析
• 1.1 由粉虱介导的供试植株的传毒实验
• 1.2 传毒后发病植株的PCR检测
• 2 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录A 常用术语缩写与中英文对照
• 附录B 实验用溶液及培养基配方
• 致谢