论文题目: 稻瘟病菌MGTA1基因的克隆与功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理与分子生物学
作者: 王教瑜
导师: 李德葆
关键词: 稻瘟病菌,致病性,基因
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 稻瘟病菌Magnaporthe grisea引起水稻的重要病害——稻瘟病,了解其致病分子机制对稻瘟病的防治意义重大。同时,作为丝状真菌致病机理与分子生物学研究的模式,M.grisea重要功能基因的克隆对了解其他病原真菌与寄主的互作也具有重要意义。M.grisea的侵入前过程,特别是附着胞的分化与形成,已经有很好的研究基础:而侵入后病菌的定殖、菌丝的分化和扩展等过程的机制却不够清楚。M.grisea刚刚侵入时,是病菌与寄主细胞建立和巩固寄生关系,获得营养以完成生活史的关键时期,了解该过程的分子机制是目前M.grisea致病机理研究的重点。豆类炭疽菌(Colletotrichum lindemuthianum)是另一种重要的植物病原真菌,与M.grisea同为附着胞介导侵入的子囊菌。二者侵入的前期过程(包括孢子萌发、附着胞分化等)很相似,调控这些过程的部分功能基因存在同源性(如CMKl与PMKl)。CLTAl是参与C.lindemuthianum侵入后菌丝分化与扩展的关键基因,ACLTAl突变子无法进行次生菌丝的分化,失去致病性。明确M.grisea中是否存在CLTAl的同源基因调控侵入后侵染菌丝的分化与扩展,有助于深入理解M.grisea菌丝扩展的分子机制及M.grisea与C.lindemuthianum侵入后过程的异同。本文克隆了CLTTAl在M.grisea中的序列同源基因MGTAl,并通过构建GFP融合蛋白研究了该基因的时空表达,通过基因取代的方法分析了MGJTAl基因在M.grisea致病及相关过程中的作用。研究结果如下: 1.利用CLTAl基因氨基酸序列在M.grisea基因组数据库中检索,获得序列相似(51%相似性)基因,定名为MGTAl。通过PCR获得了MGTAl基因的DNA克隆与cDNA克隆。通过序列测定,获得了包括启动子区和完整阅读框在内5.2kb的MGTA/基因全长。序列分析表明MGTAl开放阅读框长度为2773bp,包含6个外显子、5个内含子,编码区总长度为2370bp,编码790氨基酸残基的多肽。蛋白序列的特征分析发现MGZAl包含Zn(Ⅱ)2Cys6蛋白的三个保守结构(Zn(Ⅱ)2Cys6区、中部同源区与转录激活区)及二聚化因子区域,初步表明该MGTTAl为Zn[Ⅱ]2Cys6家族转录激活因子。 2.通过southern分析,明确了MGTTAl在Guyll及其他6种不同M.grisea菌株基因组中均为单拷贝。 3.MGTAl启动子与绿色荧光蛋白(eGFP)融合表达及RT-PCR实验表明,MGTAl
论文目录:
1.文献综述
1.1.稻瘟病与稻瘟病菌
1.2.稻瘟病菌的侵染循环
1.2.1.孢子萌发
1.2.2.附着胞的分化和成熟
1.2.3.侵入栓形成和侵入
1.2.4.侵入后的菌丝分化与扩展
1.2.5.产孢与再侵染
1.3.稻瘟病菌的重要功能基因
1.3.1.参与产孢过程的基因
1.3.2.附着胞分化相关基因
1.3.3.附着胞的成熟与膨压形成过程中的功能基因
1.3.4.侵入栓形成及侵入相关基因
1.3.5.侵入后菌丝分化及扩展相关的基因
1.3.6.其它致病性相关基因
1.3.7.基因表达的调控
1.4.稻瘟病菌基因组草图的绘制及数据库的开发利用
1.5.本研究的目的、内容和意义
2.材料与方法
2.1.MGTA1基因的确定与序列比对
2.2.菌株、培养基及培养条件
2.2.1.稻瘟病菌菌株、培养基及培养条件
2.2.2.细菌菌株、培养基及培养条件
2.3.DNA相关操作
2.3.1.基因组DNA提取
2.3.2.常规PCR、长片段PCR(＞5kb)与RT-PCR
2.3.3.PCR产物的克隆
2.3.4.序列测定
2.3.5.DNA克隆程序
2.3.6.Southern杂交
2.4.MGTA1基因的GFP表达分析
2.4.1.融合载体的构建
2.4.2.稻瘟病菌eGFP转化子的荧光观察
2.5.MGTA1基因敲除及突变子功能分析
2.5.1.基因置换载体MGTA1：：HPH的构建
2.5.2.互补载体的构建
2.5.3.稻瘟病菌原生质体的制备与转化
2.5.4.侵入相关的形态学观察
3.结果与分析
3.1.MGTA1基因的分离和克隆
3.1.1.MGTA1基因的确定
3.1.2.MGTA1基因组序列的克隆与序列测定
3.1.3.MGTA1基因cDNA片段的克隆与序列测定
3.2.MGTA1基因的序列与分析
3.2.1.MGTA1基因的序列
3.2.2.MGTA1基因的同源基因
3.3.MGTA1基因在不同稻瘟病菌菌株基因组中的拷贝数
3.4.MGTA1基因的时空表达及亚细胞定位
3.4.1.融合载体MGTA1(p)：：eGFP：：HPH的构建
3.4.2.MGTA1(p)：：eGFP：：HPH转化子的荧光表达
3.4.3.融合载体MGTA1：：eGFP：：HPH的构建
3.4.4.MGTA1：：eGFP：：HPH转化子的荧光表达
3.4.5.MGTA1基因的RT-PCR检测
3.5.MGTA1基因敲除载体的构建及目标置换过程
3.5.1.MGTA1基因敲除载体MGTA1：：HPH的构建
3.5.2.MGTA1基因的目标置换过程
3.6.两次敲除转化及⊿MGTA1突变子的获得
3.6.1.第一次敲除转化与⊿MGTA1突变子的获得
3.6.2.再次敲除转化及突变子的获得
3.6.3.MGTA1基因敲除的频率
3.7.⊿MGTA1突变子的表型(phenotypes)分析
3.7.1.⊿MGTA1突变子的菌落形态与生长速度
3.7.2.⊿MGTA1突变子的产孢量
3.7.3.⊿MGTA1突变子的分生孢子萌发、附着胞形成
3.7.4.⊿MGTA1突变子对洋葱表皮的穿透作用
3.7.5.⊿MGTA1突变子对大麦和水稻的致病性
3.7.6.⊿MGTA1突变子有性世代的产生
3.7.7.⊿MGTA1突变子对纤维素的利用
3.7.8.A17与A37的表型
3.8.突变子互补载体的构建及转化
3.9.突变子的MGTA1基因3’下游序列
4.讨论
5.小结
6.参考文献
发布时间: 2005-07-22
参考文献
- [1].Retromer复合体在稻瘟病菌和禾谷镰刀菌中的功能分析[D]. 郑文辉.福建农林大学2014
- [2].稻瘟病菌APSES转录因子Pcg2的作用及其机理的研究[D]. 王大伟.中国农业大学2014
- [3].稻瘟病菌Tctex1及其与动力蛋白中间链复合物结构解析和相互作用分析[D]. 李国瑞.中国农业大学2018
- [4].稻瘟病菌MoPEX1在形态分化和致病过程中的作用及MoSom1 PKA磷酸化位点的鉴定与功能分析[D]. 邓淑桢.浙江大学2017
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