CD11b-CD27-NK细胞参与肺癌进程

论文摘要

肺癌是当今世界上发生率和致死率最高的恶性肿瘤之一,如何有效治疗肺癌成为当务之急。在众多肿瘤治疗方法中,免疫疗法因为其新颖性和高效性而备受关注。如何研究出最有效的肿瘤免疫疗法,有待于对机体的抗肿瘤免疫应答过程有一个全面深入的了解。我们知道天然免疫系统是机体抵御恶性肿瘤的第一屏障,自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）作为天然免疫系统的重要成员,能够识别并杀伤肿瘤细胞,在机体抗肿瘤过程中扮演重要角色。然而最近有研究报道,非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma, NSCLC）病人体内的肿瘤浸润NK细胞（tumor-infiltrating NK cells, TINK cells）的杀伤功能和分泌IFN-Y能力严重缺失,并证明与TINK细胞表面各种受体的表达变化相关,而TINK细胞表面受体的表达变化是由于肿瘤细胞表面与之对应的配体表达发生变化所致,由此说明可能是肿瘤微环境造成了TINK细胞的功能缺失。值得关注的是,该研究还特别指出NSCLC病人体内的TINK细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR）表达水平低于外周血NK细胞（peripheral blood NK cells, pNK cells）.更早之前的研究也表明TINK细胞表面的KIR表达水平明显低于癌周组织中的NK细胞。有趣的是,在乳腺癌病人体内也发现了TINK细胞表面的KIR表达缺失的现象,相比之下,健康乳腺组织中的NK细胞表面的KIR则表达正常。研究还发现,乳腺癌病人体内的TINK细胞的杀伤功能也发生缺失。KIR是公认的NK细胞终端分化和功能获得的标志,而在乳腺癌病人体内只有肿瘤局部NK细胞（即TINK细胞）表面KIR表达发生缺失,由此说明具有强抑制性的肿瘤微环境可能是通过影响TINK细胞的发育分化过程,从而影响TINK细胞发挥效应功能。近期一系列研究表明,NK细胞的发育分化状态不是固定不变的,例如成熟的NK细胞可能会受所处环境的影响,发育分化状态发生再调整。这一理论很好的支持了肿瘤微环境可能会对TINK细胞的发育分化产生负面影响的推测。基于上述研究背景,本研究目的在于研究TINK细胞的发育状况,主要通过流式细胞术检测其表面CD11b和CD27这两个界定NK细胞发育的标志,试图寻找TINK细胞功能缺失与其发育状况的联系,我们获得了以下结果以及结论：1. NSCLC病人的TINK细胞中存在CD11b-CD27-亚群为了研究NSCLC病人体内TINK细胞的亚群状况,我们分别选取了NSCLC病人的TINK细胞、pNK细胞和正常人（healthy controls, HC）的pNK细胞进行检测,利用CD11b和CD27来分析这三种NK细胞的亚群状况。实验发现,无论外周血是来自NSCLC病人还是正常人,几乎所有的外周血NK细胞都是CD11b+CD27"（CD11b+SP）亚群。但是我们在NSCLC病人的TINK细胞中,不仅发现了CD11b+CD27（CD11b+SP）亚群,还发现了大量的不成熟的CD11b-CD27（DN）亚群。经过统计,我们发现TINK细胞中约35%都是CD11b-CD27-（DN）亚群,与之对应的是,TINK细胞中的成熟的CD11b+CD27（CD11b+SP）亚群比例明显低于pNK细胞。这是第一次发现人的肿瘤浸润NK细胞中有数量巨大的DN NK细胞亚群。2. CD11b-CD27亚群主要存在于CD16TINK细胞群中之前研究报道,NSCLC病人的TINK细胞主要是CD16-,我们也发现了同样的现象,即TINK细胞上的CD16表达水平明显低于pNK和HC-pNK细胞。我们知道CD16不仅可以作为NK细胞的活化型受体介导ADCC作用,而且CD16还是NK细胞发育成熟的重要标志,所以我们分别分析了CD16ˉ和CD16+TINK细胞中的亚群状况。结果发现,CD16+TINK细胞中约90%都是CD11b+SP亚群,但在CD16TINK（?）细胞中却有60%为CD11b-CD27亚群。实验表明CD11b CD27亚群主要存在于CD16-TINK细胞群中,这一点符合该亚群的不成熟特征,由此暗示TINK细胞可能表现为不成熟状态。3. TINK细胞表型不成熟且处于低活化状态为了研究TINK细胞的发育状况,我们通过流式检测了与NK细胞发育相关的表型,如CD57、CD127和CD117。 NK成熟的标志CD57,在pNK细胞表面高表达,但在TINK细胞表面表达明显下调。相反,CD127和CD117作为不成熟NK细胞的标志,仅在TINK细胞表面有表达,在pNK细胞表面几乎检测不到。以上检测结果说明TINK细胞表型不成熟。同时,我们还检测了与NK细胞活化相关的表型,如CD226、NKp30和NKG2A,其中CD226和NKp30是NK细胞的活化性受体,NKG2A是NK细胞的抑制性受体。我们发现,与pNK和HC-pNK细胞相比,TINK细胞表面的CD226和NKp30表达明显下调,这个结果与TINK细胞表面CD16表达降低现象相吻合。相反,与pNK和HC-pNK细胞相比,TINK细胞表面的NKG2A表达轻微上调。我们知道NKG2A作为抑制性受体在不成熟NK细胞表面高表达,伴随着NK细胞的发育成熟,其表达逐渐降低。TINK细胞表面NKG2A表达较高这一结果也再次验证了TINK细胞表型不成熟。综上,我们推测FINK细胞功能的缺失,是由于其发育状况相对不成熟所致。4. CD11b CD27亚群的存在导致TINK细胞表现不成熟特征为了研究是否是CD11b-CD27（DN）亚群的存在导致TINK细胞表现不成熟特征,我们分别检测了TINK细胞中的DN和CD11b+SP两个亚群的表型。比较两个亚群表面与NK细胞发育相关的表型发现,DN亚群表面的CD16和CD57表达明显低于CD11b+SP亚群,但CD127仅在DN亚群表面明显表达。以上结果表明TINK细胞中的DN亚群表型不成熟。为了进一步了解TINK细胞中的DN亚群的功能,我们分别检测了两个亚群表面与NK细胞活化相关的表型。实验证明DN亚群表面的CD226和NKp30表达低于CD11b+SP亚群。这个结果说明DN亚群处于低活化状态。综上,我们发现TINK细胞中存在的DN亚群,在表型和功能上符合之前研究报道,即DN亚群表现不成熟和低功能的特征。由此我们推断,TINK细胞中大量存在的DN亚群造成了TINK细胞表现不成熟特征。5.DN亚群与人的肿瘤疾病进程相关既然DN亚群的存在影响了TINK细胞表型和功能,那么DN亚群的存在是否也对肺癌的疾病进程有影响?为此,我们将NSCLC病人按照肿瘤恶性程度,即按照TNM （tumor node metastasis）分为三组,分别为Ⅰa/b、Ⅱa/b和Ⅲa/b。我们首先检测了TINK细胞表面的CD11b和CD27的表达,发现Ⅲa/b组的NSCLC病人的TINK细胞中的DN亚群比例明显高于其他两组。通过统计分析以上数据,我们发现随着肿瘤恶性程度的加重,相对应的NSCLC病人的TINK细胞中的DN亚群比例越高。这是首次发现DN NK细胞亚群比例与人的肿瘤疾病进程呈正相关性,同时我们还发现DN NK细胞亚群比例与手术切除的肿块的最大直径呈正相关性。这些证据都表明DN NK细胞亚群与人的肿瘤进程相关。6. DN亚群比例在荷瘤小鼠中的动态变化为了进一步验证DN亚群与肿瘤疾病进程的相关性,我们采用小鼠LLC模型（小鼠经典肺癌模型）在小鼠体内观察随着肿瘤病程加重,DN亚群的动态变化。与之前研究报道一致,随着肿瘤病程加重,小鼠体内的NK细胞比例逐渐下降。我们分别检测在荷瘤0天、10天和20天后的小鼠的TINK细胞的DN亚群比例,通过比较后发现随着肿瘤病程加重,不成熟的DN亚群比例开始逐渐升高,而成熟的CD11b+SP亚群比例逐渐降低。这些数据表明,在荷瘤小鼠体内,DN亚群比例与肿瘤病程相关综上所述,我们首次发现了有大量不成熟的DN亚群存在于TINK细胞中,并找到了这群DN NK细胞亚群与肿瘤病程的相关性。更重要的是,我们提出肿瘤微环境导致TINK细胞发育状况不成熟,从而影响了TINK细胞的效应功能,为肿瘤免疫逃逸提供了一个新解释。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 图表目录
• 第1章 绪论:NK细胞的发育及其功能
• 1.1 NK细胞的发育
• 1.1.1 NK细胞发育的场所
• 1.1.2 NK细胞发育的条件
• 1.2 NK细胞的亚群
• 1.3 NK细胞的识别
• 1.3.1 NK细胞的受体
• 1.3.2 NK细胞的识别机制
• 1.3.3 NK细胞识别自我与自身耐受机制
• 1.4 NK细胞的功能
• 1.4.1 NK细胞的效应功能
• 1.4.1.1 NK细胞的杀伤机制
• 1.4.1.2 NK细胞杀伤肿瘤细胞
• 1.4.2 NK细胞的免疫调节功能
• 1.4.2.1 NK细胞调节天然免疫应答
• 1.4.2.2 NK细胞调节获得性免疫应答
• 1.4.3 NK细胞的记忆功能
• -CD27^-NK细胞与肺癌疾病进程相关'>第2章 CD11b^-CD27^-NK细胞与肺癌疾病进程相关
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 临床标本
• 2.2.1.2 实验动物
• 2.2.1.3 细胞株
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.2.1 分离外周血单个核细胞和肺脏淋巴细胞的试剂
• 2.2.2.2 培养基与血清
• 2.2.2.3 磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）
• 2.2.2.4 流式（FACS）检测使用的抗体
• 2.2.2.5 流式（FACS）检测使用的固定液
• 2.2.2.6 ELISA检测试剂盒
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.4.1 人的外周血单个核细胞的分离
• 2.2.4.2 人的肺癌组织单个核细胞的分离
• 2.2.4.3 小鼠肺脏单个核细胞的分离
• 2.2.4.4 小鼠荷瘤
• 2.2.4.5 细胞计数
• 2.2.4.6 流式（FACS）检测细胞表面标志
• 2.2.4.7 统计学分析
• 2.3 实验结果
• -CD27^-亚群'>2.3.1 NSCLC病人的TINK细胞中存在CD11b^-CD27^-亚群
• -CD27^-亚群主要存在于CD16^-TINK细胞群中'>2.3.2 CD11b^-CD27^-亚群主要存在于CD16^-TINK细胞群中
• 2.3.4 TINK细胞处于低活化状态
• -CD27^-亚群的存在导致TINK细胞表现不成熟特征'>2.3.5 CD11b^-CD27^-亚群的存在导致TINK细胞表现不成熟特征
• 2.3.6 DN亚群与人肺癌进程相关
• 2.3.7 DN亚群比例在荷瘤小鼠中的动态变化
• 2.4 实验讨论与总结
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果
• 致谢