池王胄(上海新先锋药业有限公司上海浦东201203)
【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）12-0053-02
传统的微生物的检测、鉴定方法仍停留在分离培养形态观察、生化鉴定和血清学分型水平上，虽然其准确性较高，但涉及的实验繁多，操作烦琐、检测耗时长、检测周期长、准备与收尾工作较繁重，且需要大量工作人员参与，而且对难以培养的病原菌的检测，难度较大，检测结果存在不同程度的滞后性。因此，对微生物进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为当今微生物检测的迫切需求。目前，一些简便敏感及时的检测新思路，新方法得到改进和开发，本文主要对生物化学方法，免疫检测技术，快速测试片法，选择鉴定用培养基法，免疫检测技术，细菌直接计数法、全自动微生物分析系统等方法的研究进展作一综述。
1分子生物学技术
1.1PCR
PCR检测技术是在体外利用耐热DNA聚合酶作用合成特异性DNA片段，通过变性-延伸-复性的循环操作,将DNA模板迅速扩增数百万倍后,再通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA产物的荧光条带,以确定微生物的特定种类的技术。其具有高度的敏感性和特异性，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此，在检测中大大缩短了增菌的时间。另外PCR技术在16S-23S区间序列的扩增也可以用于16S不能鉴别、非常接近的菌种和种内细菌之间的鉴别。而荧光定量PCR技术改变了PCR定量较差的缺点，对李氏杆菌、大肠杆菌、肉毒杆菌、沙门杆菌等病原菌能有效的定量检查[1]。
PCR检测受检测物成分、增菌培养基成分、扩增过程操作等影响，某些微生物DNA对Taq酶具有抑制作用也可能导致检验结果出现假阴性或假阴性；其操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后产生假阳性结果。而且，它仅限于核酸序列已知的微生物的鉴定，不能区分活细胞和死细胞，一次只能对一种病原菌进行检测，对不同的样本检测不同的病原菌，就需要多次检测，效率低，周期长。荧光定量ＰＣＲ技术，虽然较为准确，但成本较高，对不同的病原菌需要合成不同的荧光标记的探针，价格昂贵，不易在基层开展。
1.2基因探针技术
DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。其利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNA-RNA或DNA-DNA链的原理,采用高度特异基因片段制备基因探针来识别细菌。探针需要附加适当的标记,如放射性同位素、酶或者发光的标识物。与传统方法相比基因探针技术具有快速、灵敏的特点，减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。据报道，能从1t水中检测出10个病毒来，精确度大大提高[2]。
但是该方法每检测一种菌就需要制备一种探针,对尚未建立的菌种以及目标菌以外的其他菌不能鉴定，还有待进一步发展。
1.3基因芯片技术
基因芯片是采用微加工和微电子技术将数以万计、乃至百万计的基因寡核苷酸有序地、高密度地排列在硅片、玻片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针,再与芯片上寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。
微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，通用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较，从而来确定检测样品是否存在某些特定微生物。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，理论上，基因芯片可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，从而解决了传统核酸印迹杂交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，具有简便快速、特异性强、可并行检测等诸多优点。然而，基因芯片技术虽然有很好的发展前景，芯片制作、样品采集、处理技术等方面也有了长足的发展。但是其依然存在技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度相对较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。在这些方面仍然有待改进[3]。
2免疫学技术
免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。由于免疫检测技术具备高度的灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度样品，在进行选择性增菌后，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成达到检出度，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于其效果较好，对技术要求也不十分的高，目前在基层单位应用较为广泛。
2.1乳胶凝集反应
乳胶凝集反应是人工大分子乳胶颗粒标记抗体与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应,以达到检测目标病原微生物或毒素的目的。如AureusTest试剂盒中含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白的IgG,当含有金黄色葡萄球菌的样品悬加入含乳胶粒子的剂盒中时1min内将产生凝聚反应,灵敏度和特异性均较高[4]。
2.2酶联免疫法（ELISA）
ELISA是把抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。它既可测抗原，也可测抗体。有报告表明ELISA法研究大肠埃希氏杆菌内毒素时比DNA探针技术更灵敏、快速[5]。
2.3免疫磁性分离法
免疫磁性分离法是把特异性的抗体偶联于磁性的颗粒的表面，由于它能特异性地与靶物质结合并使之具有磁响应性，因此将免役磁性微球与待检测的微生物的复杂混合物共同培养。则免疫性微球可以通过抗原抗体反应选择性地与待检测的微生物的靶物质结合，当此化合物通过一个磁场装置时，与免疫磁性微球结合的微生物就会被磁场滞留，从而快速的将微生物从样品中分离出来。其对沙门氏菌、溶血性弧菌均有较好的检出效果[6]。
3选择、鉴定用培养基法
选择鉴定用培养基法:该方法是通过在培养基里面加入特异性的荧光反应底物、生化反应底物抗体以及酶反应底物等，可使目标培养物的选择分离以及鉴定等程序一次性完成。该方法对操作者要求不高，操作简便，在经过短期的培训后就可以上岗，可在较短的时间取得经济效益和社会效益，因此，应用前景广泛。
4快速测试片法
测试片是以纸片、冷水可凝胶和、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。目前已经有许多微生物检测纸片，以滤纸和美国3M公司生产的PF(Petrilm)试纸常用。这些纸片法检测与传统检测方法之间的相关性好[7]。可分别检测菌落总数、大肠菌群、霉菌、沙门菌、葡萄球菌等。其与国标方法比较,最大优点是省却了繁重的准备工作;可测定少量检品，不需要增菌,直接接种纸片,适宜温度培养后计数,使用后经灭菌便可弃置,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价格低廉。
5细菌直接计数法
细菌直接计数法主要包括流式细胞仪(FCM)和固相细胞计数(SPC)法。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时进行多参数测量，因此可同时对目的菌进行定性和定量分析。目前已经建立了细菌总数、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌等的FCM检验方法[8]。SPC结合FCM和落射荧光显微镜技术,不需进行前增菌,可快速计数滤膜上(固相)的单个细胞(细胞计数)。该技术尤其适用于检测生长缓慢的微生物。
6全自动微生物分析系统(AMS)
AMS是一种由传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合,运用概率最大近似值模型法进行自动微生物检测的技术,它以每种细菌的微量生化反应为基础，无须经过微生物分离培养和纯化过程，就能直接从样品检出特殊的微生物种类和菌群来，可鉴定由环境、原料及产品中分离的405种微生物[9]。AMS能同时进行多个样品的分析仅需4～18h即可报告结果,速度快、易操作、结果准确。具有极强的应用价值,但价格昂贵，在基层不易开展。
7结束语
微生物的快速检测方法在生活中方面起着越来越重要的作用。随着免疫学、分子生物学、自动化和计算机技术、基因芯片技术及自动微生物检测系的发展，快速检测方法将从根本上改变微传统的检测方法。具有非常广阔的应用前景。但是快速检测方法还有许多需要完善和改进的地方，从定性和定量检测技术两方面出发,保证快速检测方法的准确性、可靠性，并使其灵敏度及准确度要能达到标准限量要求是当前的主要课题。在实践中使用快速检测技术，必须熟练掌握各种快速方法的优缺点，选择适合现实情况的方法。快速检测方法发展应更加实用，要提高检测产品质量，使检测特异性、灵敏度、准确性提高，实现快速检测标准化、国产化，降低相关技术及产品的使用成本，才能更好的推广快速检测技术。总之、随着科学技术的不断进步，相信各种新型的快捷简便的检测技术将会得到应用发展，满足人们的需要。
参考文献
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[2]HSchraft,LAWatterworth1Enumerationofheterotrophs,fecalcoliformsandEscherichiacoliinwater:comparisonof3MTMPetrifilmTMplateswithstandardplatingprocedures[J]1JMicrobiolMeth,2005,60(3):335-3421
[3]翟旭,孙靖靖.微生物快速检测方法及应用进展[J].辽宁医学院学报,2008,06:0564-567
[4]高军秀潘世珍关鹤玲.微生物快速检测方法及应用进展[J].医学信息,2011,09:4975
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[6]兰睿赜;叶淑红;卢兴旺;蒋明.海产贝类食用安全微生物快速检测方法的建立及应用[J].海洋环境科学;2010，04：256-257
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[8]王晓英.固相细胞计数法一种快速检测单细胞细菌的食品微生物新检测方法[J].国外医学卫生学分册,2003,30(3):183-186.
[9]杨毓环,陈伟伟.VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用[J].海峡预防医学杂志,2000,6(3):38-39