胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究

论文摘要

为了应用胆固醇氧化酶来降解和转化食品中的胆固醇,以本实验室筛选的青霉TS406菌株为对象,从诱变育种、胆固醇氧化酶的提纯、胆固醇氧化酶的酶学性质、胆固醇氧化酶降解蛋黄胆固醇等方面进行了研究。青霉TS406是一株产生胞外胆固醇氧化酶的菌株,在理化因子单因素诱变的基础上,通过紫外线联合硫酸二乙酯（浓度3%）和紫外线联合亚硝基胍（1.2mg/ml）两次连续复合诱变,获得了一株高产型突变株,其产酶活力从546U/L提高到了1267U/L,酶活提高了273%,并利用SPSS软件分析证明了突变菌株的产酶稳定性。通过硫酸铵盐析,Sephadex G-75凝胶层析,DEAE-Sephadex A50离子交换层析等方法分离提纯了菌株TS406产生的胆固醇氧化酶（COD）,其比活力为16.068u/mg,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该胆固醇氧化酶的分子量为30KD,并且证明了该胆固醇氧化酶为单一的肽段。在不同条件下测定胆固醇氧化酶的活性,得到胆固醇氧化酶的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.5,在≤40℃的条件下能够稳定保藏,在不同的反应时间对胆固醇的氧化降解反应呈现不同的规律,反应的Km值为5.0×10-4。将胆固醇氧化酶与蛋黄反应,发现作用24小时后蛋黄胆固醇的降解率达到33.8%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 文献综述
• 1.1 胆固醇及其生理功能
• 1.2 胆固醇氧化酶的来源
• 1.3 胆固醇氧化酶的基本性质
• 1.4 胆固醇氧化酶的分离纯化研究
• 1.5 分离纯化中存在的问题及发展方向
• 1.6 胆固醇氧化酶的应用
• 2 选题意义
• 第二章 胆固醇氧化酶产生菌TS406的复合诱变育种
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 诱变方法的确定
• 2.2 高产菌株的筛选
• 2.3 稳定性检验
• 2.4 突变菌株的生理生化鉴定
• 3 结论
• 第三章 胆固醇氧化酶的分离纯化
• 1 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.2 酶活力的测定
• 1.3 蛋白质浓度的测定
• 1.4 缓冲液的配制
• 1.5 粗酶液的制备
• 1.6 硫酸铵沉淀
• 1.7 葡聚糖G75凝胶层析
• 1.8 DEAE-Sephadex A-50层析
• 1.9 不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2 结果分析
• 2.1 最佳盐析浓度的确定
• 2.2 葡聚糖G75凝胶层析洗脱曲线
• 2.3 DEAE-Sephadex A-50洗脱曲线
• 2.4 不同步骤的分离纯化效果计算
• 2.5 SDS-PAGE测分子量
• 3 结论
• 第四章 胆固醇氧化酶的性质
• 1 材料及方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果分析
• 2.1 最适pH值
• 2.2 最适温度
• 2.3 热稳定性曲线
• 2.4 反应进程曲线
• 2.5 Lineweaver-Burk双倒数曲线
• 3 结论
• 第五章 胆固醇氧化酶在蛋黄中的应用研究
• 1 实验方法
• 1.1 蛋黄中总胆固醇含量的测定
• 1.2 胆固醇氧化酶对蛋黄的降解实验
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋黄胆固醇的降解效率
• 2.2 蛋黄胆固醇降解后的表观特征
• 3 结论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢