论文摘要
制备高效抑制素抗体对羊进行被动免疫具有经济、安全、效果好等优点。然而,如何以少量的抗原制备高效抗体成为进一步深入研究被动免疫的作用机制,并将该技术加以推广应用的难题。本研究采用母鸡作生物反应器,以人工合成的抑制素α亚基抗原肽作为免疫原,制备抑制素卵黄抗体,以研究抑制素被动免疫对山羊生殖激素及卵泡颗粒细胞凋亡的影响。使用重氮苯法将血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）与人抑制素α亚基（1-26）Gly·Tyr连接作免疫原,免疫16只20周龄健康本地良种产蛋母鸡,以后每隔21天进行加强免疫,共加免5次,每次免疫注射2ml。初免时使用弗氏完全佐剂,免疫原用量为600μg/2ml;加免使用弗氏不完全佐剂,免疫原用量为300μg/2ml。对照组只注射佐剂与生理盐水的乳化物,免疫程序与试验组相同。每次免疫后10天收集鸡蛋一次,经ELISA检测,提取抗体效价高的(卵黄液稀释1000倍,OD450＞0.80,酶结合率＞9%)卵黄液,并合并。收集的卵黄液,纯化后冻干保存。用ELISA法分别测定纯化抑制素卵黄抗体（eIgY）、eIgY冻干品（冻干当天及保存一个月后）的抗体效价。结果表明:提纯冻干品在—20℃保存一个月,抗体效价不受影响（P＞0.05）。经阻断抑制法检验,制备的eIgY特异性强,与卵泡刺激素（FSH）无交叉反应。本试验检测了eIgY的生物活性,将30只45日龄,体重为100-115g,未成熟的健康雌性Wistar大鼠,随机分为6个组,每组5只,分别每天注射100ul、200ul、400ul、800ul提纯eIgY、10IU FSH或800ul阴性卵黄液,连续注射3天,第5天取出子宫,剥离附着脂肪组织后称重,测定该抗体的生物效应。结果表明:100ul抗体处理组与阴性对照组相比其子宫增重效应有提高的趋势（分别为1.47±0.28,1.22±0.31）,尽管差异不显著（P＞0.05）;而200ul、400ul、800ul抗体处理组及10IU FSH处理组对子宫增重效应（分别为3.15±0.33、3.43±0.55、3.52±0.46和2.77±0.99）显著高于阴性对照组（1.22±0.31）（P＜0.01）;结果表明当抗体用量超过200ul时,其产生的子宫增重效应不依赖抗体剂量,为后续的抑制素被动免疫剂量效应,即筛选最佳免疫抗体剂量的研究提供了重要的参考。为了研究抑制素被动免疫对山羊生殖激素的影响,将12只黄体中期健康雌波尔山羊分为两组,每组6只,并对山羊肌注前列腺素F-（2α）（Prostaglandin F-（2α）,PGF2a）（2mg/只）进行同期发情处理,在发情当天,试验组颈静脉注射上述eIgY,20mL/只,含抗体2mg,对照组注射生理盐水,20mL/只。测定注射后0、6、12、24、48、72、96、120小时血液中FSH、促黄体素释放激素（LH）、雌二醇（E2）和孕酮（P）的含量。结果表明:注射抗抑制素卵黄抗体后,母羊外周血液FSH水平迅速上升,注射后12h达到高峰,直至96h保持显著高于对照组的水平,之后逐渐下降,在注射后120h降至对照组水平;免疫后母羊血液LH水平一直处于平缓状态,低于对照组;免疫12h后母羊外周血液E2开始升高,48h达到高峰后开始下降,直到120h仍高于对照组;免疫后12h—96h母羊外周血液P高于对照组。本文首次研究了抗抑制素抗体对山羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,将卵泡颗粒细胞在12孔细胞培养板上培养成单层后,分别加入抑制素（20IU/ml）、抑制素抗体（稀释100倍）、和FSH（10ng/ml）处理,每种处理3孔,另外3孔作空白对照。于处理后1、4、8、12、16、20、24、48h取样,用荧光染色法计算凋亡率。结果显示,抑制素抗体组与FSH组一样能够显著抑制卵泡颗粒细胞凋亡（P＜0.01）。试验结果表明用人抑制素α亚基（1-26）Gly·Tyr与KLH连接作免疫原免疫母鸡,获得大量高效价、高特异性的抗抑制素eIgY。用纯化的抗抑制素eIgY免疫山羊后,山羊血液中FSH、E2和P水平提高;血液中LH的水平降低。在体外原代培养条件下,抗抑制素eIgY可延缓卵泡颗粒细胞凋亡的速度。研究结果丰富了抑制素被动免疫领域的研究资料,也为进一步研究抑制素被动免疫对山羊生殖生理的影响机制奠定了基础。