人血小板冷冻干燥保存的实验研究

论文摘要

血小板输注在临床上的应用越来越广泛，提高血小板体外保存时间和质量成为输血医学的研究热点之一。冷冻干燥法具有室温下长期保存、复水后迅速恢复活性、重量轻便于运输等优点，为血小板的长期保存提供了一种理想的方法。但是，目前血小板的冷冻干燥保存技术还有许多未解决的问题，离临床医学的应用还有很大的距离。本文在国家自然科学基金项目“超声波在生物材料玻璃化保存中的应用”（项目编号：50076039）及卫生部科学研究基金项目“血小板冻干保存方法的研究”（项目编号：WKJ2005-2-037）的资助下，采用冷冻干燥的方法保存血小板，以提高冷冻干燥血小板的存活率为目标，进行了以下研究工作： 自行研制了一套实验型冷冻干燥装置，首次将新型自动复叠循环用于冷冻干燥装置的制冷系统，成功地用单级压缩机系统使搁板温度达到-60℃，冷阱温度达到-80℃。该装置温度、压力、质量的测量和控制功能齐全，弥补了现有实验型冻干装置存在的不足，为血小板的冷冻干燥实验提供了必要的实验条件。 采用差示扫描量热技术测量血小板冻干悬浮液和冻干样品的玻璃化转变温度，并对影响血小板冻干悬浮液和冻干样品玻璃化转变温度的因素进行分析，为制定合理的冻干工艺提供依据。牛血清白蛋白的加入提高了冻干悬浮液及冻干样品的玻璃化转变温度。海藻糖浓度的增加使冻干悬浮液的玻璃化转变温度显著升高，冻干样品的玻璃化转变温度略有升高。海藻糖、乳糖、麦芽糖冻干悬浮液及冻干样品的玻璃化转变温度较高且相差不大，蔗糖次之，而葡萄糖冻干悬浮液及冻干样品的玻璃化转变温度远低于其他几种糖。血小板浓度对冻干悬浮液及冻干样品的玻璃化转变温度几乎没有影响。除了含20％葡萄糖的配方外，血小板冻干配方溶液的玻璃化转变温度最低为-36.2℃，冻干粉的玻璃化转变温度最低为35.3℃，因此，确定在血小板冷冻干燥的实验中冻结温度为-40℃，升华干燥温度为-38℃，贮存温度为低于30℃的室温。 采用热穿孔方法通过温度控制的液相内吞途径将海藻糖载入血小板。在此基础上，检验细胞内海藻糖和细胞外保护剂在血小板冻干保存中分别所起的作用。在细胞外海藻糖浓度为50mmol／L，孵化温度37℃，孵化时间4h的优化条件下，血小板内部的海藻糖浓度达到约15mmol／L。在细胞内海藻糖浓度为15mmol／L，细胞外保护剂为1％牛血清白蛋白及1％海藻糖的情况下冻干血小板，实验结果证明了仅细胞外保护剂能够得到较高的冻干血小板数值恢复率，细胞外保护剂在血小板冻干保存过程中起到主要的保护作用，而15mmol／L细胞内海藻糖自身不足以提供血小板的冻干保护，只是在细胞外保护剂提供主要保护作用的基

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 血小板概述
• 1.1.1 血小板的结构和功能
• 1.1.2 血小板输注
• 1.2 血小板的保存
• 1.2.1 22 ℃振荡液态保存血小板
• 1.2.2 低温冷冻保存血小板
• 1.2.3 其他方法
• 1.3 细胞冷冻干燥的优点及基本程序
• 1.3.1 细胞冷冻干燥的优点
• 1.3.2 细胞冷冻干燥的基本程序
• 1.4 血小板冷冻干燥的损伤和保护机理
• 1.4.1 血小板冷冻干燥的损伤机理
• 1.4.2 血小板冷冻干燥的保护机理
• 1.4.3 海藻糖在冷冻干燥中的保护机理
• 1.5 冷冻干燥保存血小板的研究现状
• 1.5.1 冷冻干燥保存血小板的研究历史
• 1.5.2 冷冻干燥保存血小板的生物学特征
• 1.5.3 冷冻干燥保存血小板存在的问题
• 1.6 本文的研究内容
• 第二章 实验型冷冻干燥装置的研制
• 2.1 实验型冻干机的生产现状
• 2.2 实验型冷冻干燥装置的组成
• 2.2.1 制冷系统
• 2.2.2 真空系统
• 2.2.3 加热系统
• 2.2.4 称重系统
• 2.2.5 数据测量控制系统
• 2.2.6 电气控制系统
• 2.3 实验型冷冻干燥装置的特点
• 2.4 本章小结
• 第三章 血小板冻干配方的玻璃化转变温度与冻干工艺
• 3.1 玻璃化转变温度及其测量
• 3.1.1 玻璃化与玻璃化转变温度
• 3.1.2 差式扫描量热法测量玻璃化转变温度
• 3.2 血小板冻干悬浮液玻璃化转变温度 Tg’的测量
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.3 血小板冻干样品玻璃化转变温度 Tg的测量
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.2 结果与分析
• 3.4 血小板冻干工艺的确定
• 3.5 本章小结
• 第四章 细胞内海藻糖在血小板冻干中的作用
• 4.1 海藻糖载入细胞的方法及其应用
• 4.1.1 热穿孔
• 4.1.2 可开关细胞膜孔
• 4.1.3 基因修改
• 4.1.4 电穿孔
• 4.1.5 显微注射
• 4.2 利用热穿孔法将海藻糖载入血小板
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.2 结果与分析
• 4.2.3 讨论
• 4.3 细胞内海藻糖在血小板冻干保存中的作用
• 4.3.1 材料与方法
• 4.3.2 结果与分析
• 4.3.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第五章 血小板冷冻干燥保存的优化实验研究
• 5.1 保护剂对血小板冻干保存的影响
• 5.1.1 冻干保护剂的选择
• 5.1.2 材料与方法
• 5.1.3 结果与分析
• 5.1.4 讨论
• 5.2 冻结速率对血小板冻干保存的影响
• 5.2.1 材料与方法
• 5.2.2 结果与分析
• 5.2.3 讨论
• 5.3 血小板初始浓度对血小板冻干保存的影响
• 5.3.1 材料与方法
• 5.3.2 结果与分析
• 5.3.3 讨论
• 5.4 优化条件下血小板冻干保存的效果
• 5.4.1 冻干血小板的扫描电镜观察
• 5.4.2 冻干血小板的聚集功能检测
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望与建议
• 参考文献
• 本文创新点
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 致谢