真空包装烟熏火腿切片特定腐败菌及靶向抑制研究

论文摘要

低温肉制品因其特有的营养成分和组织结构,如脂肪、蛋白质含量丰富、肉质鲜嫩,风味浓郁,很受消费者的青睐,成为未来肉制品发展的方向。但低温肉制品水分活度较高,pH值也相对较高,加之在加工过程中灭菌不彻底,在后期的储存和销售过程中,一旦条件适宜或受到污染,产品中残留的细菌就会迅速地生长繁殖,导致产品腐败,产生诸如褪色、出水、出油、发黏、风味差、胀袋等不同程度的质量问题。如何延长低温肉制品的货架期,是摆在许多肉制品生产企业面前的一道难题。因此,以低温肉制品腐败微生物控制技术为核心的品质控制技术和综合保鲜技术研究,成为低温肉制品研究与产业化的关键问题。本研究的目的是运用DNA指纹图谱技术等现代生物技术,结合传统的微生物分离技术,以典型低温肉制品—真空包装烟熏火腿切片为代表,分离、鉴别其中的主要腐败微生物菌相,揭示低温火腿切片中特定腐败菌（SSO）的动态消长规律,及其对产品品质的影响机制;对产品中腐败菌相的形成加以确切阐述,建立快速准确地确定低温肉制品中特定腐败菌的方法及主要污染源追溯方法,确定关键质量控制点（CCP）。并进一步研究应用生物保护菌靶向抑制低温肉制品中特定腐败菌的生物效应;最终,为低温肉制品的生产、贮藏和流通过程中的品质安全保障提供理论依据和技术支持。具体研究内容和结果如下:1.真空包装烟熏火腿切片贮藏特性研究对不同温度贮藏条件下真空包装烟熏火腿切片的贮藏特性进行研究。结果表明,真空包装烟熏火腿切片初始pH值为6.42,Aw值为0.982,蛋白含量16.8%,脂肪含量3.3%,水分含量70.3%,初始菌数为102～103CFU/g。产品很容易腐败变质。产品在贮藏过程中,pH值呈下降趋势,TVB-N值和可溶性蛋白呈上升趋势,L*值下降,a*、b*值上升,Aw值、脂肪含量及TBARS值变化不明显。贮藏温度对产品质量和货架期影响显著,低温可以延长产品货架期。产品腐败表现为:腥臭味,酸腐味,颜色淡泊无光泽,质地松散无弹性,出水,产黏和产气。腐败胀袋气体的主要成分是二氧化碳、此外还含有乙醇等醇类物质、乙酸等挥发性酸类化合物。贮藏期间,微生物达到的最大菌落数量为108CFU/g,以此为指标判断产品的货架期与感官判断一致。乳酸菌是真空包装烟熏火腿切片中的主要微生物,其次是肠杆菌科菌、假单胞菌、葡萄球菌/微球菌占少数,产品中有酵母菌污染。2.产品贮藏期间微生物种群动态变化及主要腐败菌菌相分析采用DGGE技术和传统微生物培养相结合的方法,分析探讨真空包装烟熏火腿切片中污染细菌的多样性和贮藏过程中的动态变化并分离、鉴别其中主要的腐败菌菌相。结果表明,产品贮藏初期污染微生物具有很高的多样性,但贮藏过程中逐渐发展成为少数特定腐败菌生长占优势,它们具有很强的生长竞争力,抑制了其它微生物的生长,造成产品质量劣变的特征性腐败。两种方法结合共分离出真空包装烟熏火腿切片中主要腐败菌,它们分别代表:清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）,弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）,明串珠菌属的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和非培养的明串珠菌（Uncultured Leuconostoc sp.）3.腐败菌对真空包装烟熏火腿切片的质量影响通过分析腐败细菌产生腐败现象的腐败潜能和其产生腐败代谢产物的活力,研究导致产品腐败的微生物效应。结果表明:肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）利用肉基质中的葡萄糖进行异型发酵产生二氧化碳、乙酸、丙醇、丁醇,并分解蛋白质等含氮化合物造成TVB-N值升高。是造成真空包装烟熏火腿切片“空皮”,出水、“胀袋”、结构松散、颜色灰白等腐败现象的特定腐败菌。清酒乳杆菌清酒亚种（Lactobacillus sakei subsp.sakei）优先发酵肉制品中的糖类产生乳酸、乙酸等酸性物质,造成pH值下降;产生黏多糖（葡萄糖-半乳糖多聚糖）,形成黏液;生成酪胺、腐胺等典型腐败物质,产生腐败味。是造成真空包装烟熏火腿切片发酸变味、发黏起丝等腐败现象的特定腐败菌。弯曲乳杆菌蜜二糖亚种（Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus）优先发酵肉制品中的糖类产生乳酸、乙酸、乙醇等物质,产生黏多糖（葡萄糖-半乳糖多聚糖）,并产生大量尸胺、腐胺、酪胺等典型腐败物质。是造成真空包装烟熏火腿切片发酸变味、发黏起丝、颜色暗淡、腐败臭味的特定腐败菌。4.加工过程中的微生物种群差异性分析运用DGGE技术分析烟熏火腿切片加工过程中主要生产关键环节的微生物种群多样性,通过比较各个污染环节微生物种群的差异,得出它们与产品中主要腐败菌的相互关系,结果表明:真空包装烟熏火腿切片中主要腐败菌来源于原料肉。生产过程中容易发生污染的环节是滚揉和热处理后的冷却过程。防腐剂使用不当会给产品带来安全隐患。5.生物保护菌对特定腐败菌的靶向抑制作用研究评价运用清酒乳杆菌B-2（Lactobacillus sakei B-2）作为生物保护菌对延长真空包装烟熏火腿切片在4℃贮存货架期的作用。通过描述微生物在肉制品低温贮藏期间的动态变化过程,阐述生物保护菌与抑制目标菌之间是否有相互作用。结果表明,真空包装烟熏火腿切片接种清酒乳杆菌B-2 5.91±0.04 log10 CFU/g,于4℃贮藏,货架期为35 d,对照样货架期为15 d。使用生物保护菌L.sakei B-2抑制了低温肉制品中的主要腐败菌清酒乳杆菌（L.sakei）弯曲乳杆菌（L.curvatus）和肠膜明串珠菌（Leuconostoc.mssenteroides）,但是不能完全抑制非培养的明串珠菌（unculturedLeuconostoc）。应用传统微生物分离培养方法和分子生物学方法清楚地阐明了生物保护菌对目标菌的抑制效果。PCR-DGGE技术作为一种有效的技术手段,可以直观、准确地分析生物保护菌应用于延长低温肉制品货架期,微生物种群的动态变化。更好地了解生物保护菌与目标菌之间的靶向抑制作用有利于生物保护菌在肉制品中的正确应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写符号
• 表格索引
• 图形索引
• 前言
• 上篇 文献综述
• 1 低温肉制品特点及发展状况
• 1.1 低温肉制品的特点
• 1.2 低温肉制品的发展状况
• 2.低温肉制品中腐败微生物研究状况
• 2.1 低温肉制品的微生物腐败
• 2.2 低温肉制品中的特定腐败菌（SSO）
• 2.2.1 特定腐败菌的概念
• 2.2.2 特定腐败菌SSO的确定
• 2.2.3 SSO之间的相互作用
• 2.2.4 低温肉制品中的SSO的确定
• 2.2.5 低温肉制品中SSO的影响因素
• 2.2.6 低温肉制品的SSO产生的腐败
• 2.2.7 腐败分析研究
• 3.肉类腐败控制技术研究现状及发展趋势
• 3.1.现代食品保鲜理论
• 3.1.1 栅栏因子理论与多靶保藏
• 3.1.2 特定腐败菌（SSO）与靶向抑制
• 3.2 国内肉制品保鲜研究现状
• 3.3 新型肉制品保鲜技术—生物保护菌（BIOPROTECTIVE CULTURE）
• 4 食品微生物分离、鉴定技术
• 4.1 发展综述
• 4.2 PCR-DGGE/TGGE技术
• 4.2.1 PCR-DGGE技术在食品微生物中的应用
• 4.2.2 DGGE技术在肉品微生物研究中的应用
• 5.存在问题和本研究的意义
• 参考文献
• 下篇 研究报告
• 第一章 真空包装烟熏火腿切片贮藏特性研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 真空包装烟熏火腿切片加工工艺
• 1.1.1.2 取样及处理
• 1.1.1.3 试剂及培养基
• 1.1.1.4 仪器及设备
• 1.1.2 研究方法
• 1.1.2.1 感官评定
• 1.1.2.2 pH值测定
• w）的测定'>1.1.2.3 水分活度（A_w）的测定
• 1.1.2.4 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定
• 1.1.2.5 TBARS值的测定
• 1.1.2.7 色泽的测定
• 1.1.2.8 蛋白、脂肪及水分含量的测定
• 1.1.2.9 胀袋气体成分的分析
• 1.1.2.10 微生物检测
• 1.1.3 数据处理
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 不同贮藏温度下样品的感官品质变化
• 1.2.2 不同贮藏温度条件下样品PH的变化
• 1.2.3 不同贮藏温度样品TBARS值的变化
• 1.2.4 不同贮藏温度样品TVB-N值的变化
• *,A^*,B^*值的变化'>1.2.5 不同贮藏温度样品L^*,A^*,B^*值的变化
• 1.2.6 不同贮藏温度样品可溶性蛋白、脂肪、水分含量的变化
• w）的变化'>1.2.7 不同贮藏温度下样品水分活度（A_w）的变化
• 1.2.8 不同贮藏温度样品微生物的变化
• 1.2.9 腐败胀袋气体成分分析
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 参考文献
• 第二章 微生物种群动态变化及主要腐败菌菌相分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 样品制备
• 2.1.1.2 主要仪器和试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 pH测定
• 2.1.2.2 微生物测定
• 2.1.2.3 优势腐败菌的分离、纯化和部分鉴定
• 2.1.2.4 细菌总DNA的提取
• 2.1.2.5 巢式PCR（Nest PCR）
• 2.1.2.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.1.2.7 EB染色
• 2.1.2.8.成像与分析
• 2.1.2.9 DNA回收和纯化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PH值及微生物变化分析
• 2.2.2 优势腐败菌的分离、纯化和部分鉴定
• 2.2.2.1 菌株的培养特征、形态特征和部分生理生化特性
• 2.2.2.2 优势腐败菌的分子鉴定
• 2.2.3 直接从样品中提取总细菌DNA的菌相分析结果
• 2.2.3.1 总的细菌16S rDNA的V3可变区PCR结果
• 2.2.3.2 DGGE图谱及分析
• 2.2.3.3 割胶条带测序结果分析
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 腐败菌对真空包装烟熏火腿切片质量的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.1.1 样品制备
• 3.1.1.2 主要仪器和试剂
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.3 测定的指标和方法
• 3.1.3.1 pH值的测定
• 3.1.3.2 微生物的测定
• 3.1.3.3 挥发性盐基氮（TVBN,Totol volatile basic nitrogen）的测定
• 3.1.3.4 色差的测定
• 3.1.3.5 生物胺的测定
• 3.1.3.5 胀袋气体成分分析
• 3.1.4 数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 乳酸菌数的变化
• 3.2.2 PH值的变化
• 3.2.3 TVB-N值的变化
• *,A^*,B^*值的影响变化'>3.2.4 不同腐败菌对L^*,A^*,B^*值的影响变化
• 3.2.5 HPLC测定的生物胺含量变化
• 3.2.5.1 标准品衍生的色谱条件
• 3.2.5.2 标准曲线的回归方程及方法的检测限
• 3.2.5.3 真空包装火腿切片中生物胺的分析
• 3.2.5.4 腐败菌对真空包装火腿切片中生物胺的影响分析
• 3.2.6 胀袋气体分析
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 加工过程中微生物种群差异性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 2.1.1.1 样品制备
• 2.1.1.2 主要仪器和试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 试验方法
• 2.1.2.2 样品直接提取总细菌DNA
• 2.1.2.3 巢式PCR（Nest PCR）
• 2.1.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.1.2.5 EB染色
• 2.1.2.6 成像与分析
• 2.1.2.7 DNA回收和纯化
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 样品A直接提取总细菌DNA的细菌分析结果
• 4.2.1.1 总的细菌16S rDNA的V3可变区PCR结果
• 4.2.1.2 DGGE图谱及分析
• 4.2.1.3 割胶条带测序结果分析
• 4.2.2 样品B直接提取总细菌DNA的细菌分析结果
• 4.2.2.1 总的细菌16S rDNA的V3可变区PCR结果
• 4.2.2.2 DGGE图谱及分析
• 4.2.2.3 割胶条带测序结果分析
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 生物保护菌对特定腐败菌的靶向抑制作用研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 保护菌准备
• 5.1.2 样品制备
• 5.1.3 材料
• 5.1.4 方法
• 5.1.4.1 pH值测定
• 5.1.4.2 微生物检测
• 5.1.4.3 感官评定
• 5.1.4.4 直接提取细菌总DNA
• 5.1.4.5 PCR、DGGE及染色成像
• 5.1.4.6 DGGE图像及序列鉴定
• 5.1.5 数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 微生物变化
• 5.2.2 PH值和感官变化
• 5.2.3 通过DGGE图像分析火腿切片中微生物动态变化
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 创新说明
• 工作展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文