小鼠Foxp3-△PRD/△FKH基因克隆及其功能的研究

论文摘要

目的:克隆小鼠Foxp3-△PRD（N末端富含脯氨酸区域缺失的Foxp3片段）和Foxp3-△FKH（C末端FKH区域缺失的Foxp3片段）基因,构建带穿膜序列PTD（protein transduction domain）的原核表达载体,表达、纯化并复性PTD-△PRD、PTD-△FKH、PTD-eGFP-△PRD、PTD-eGFP-△FKH融合蛋白,并初步探讨其生物学功能,为进一步研究Foxp3的免疫抑制机制奠定基础。方法:（1）利用PCR技术扩增获得小鼠△PRD和△FKH基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行单、双酶切鉴定及序列分析。（2）将测序正确的△PRD和△FKH基因克隆到带穿膜序列的pET28a-PTD和pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta（DE3）中表达,获得带有His标签的融合蛋白,利用Bio-Rad公司的镍柱纯化融合蛋白,并进行蛋白复性。（3）利用Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性,流式细胞术和Western-blot检测融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖能力的调节。结果:成功构建了具有穿膜功能的原核表达载体,表达、纯化并复性了带His标签的融合蛋白,Western-blot证实了融合蛋白表达的准确性,流式细胞术和Western-blot证实PTD能携带Foxp3相关蛋白有效的进入细胞内,同时经混合淋巴细胞反应证明PTD-△PRD融合蛋白抑制T细胞活化增殖的能力高于PTD-△FKH融合蛋白,说明C末端的FKH区域在Foxp3的抑制功能中起重要的作用,而N末端的富含脯氨酸区域也具有一定的抑制功能。结论:成功表达具有生物学活性的带穿膜序列的Foxp3相关融合蛋白,Western-blot和流式细胞术证实融合蛋白能有效地进入细胞并定位于细胞核内,为进一步研究Foxp3的其它功能片段及其免疫抑制机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 Foxp3在免疫调节中的作用
• 1.1.1 调节性T细胞及其在免疫调节中的作用
• 1.1.2 Foxp3的一般特性
• 1.1.3 Foxp3的生物学功能
• 1.1.4 Foxp3的信号通路
• 1.1.5 Foxp3在自身免疫性疾病中的作用
• 1.2 PTD在蛋白转导中的作用
• 1.3 本研究的目的和研究内容
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究意义
• 1.3.3 研究方法及技术
• 1.3.4 试验方案的设计
• 第二章 小鼠Foxp3-△PRD/△FKH基因的克隆
• 2.1 材料方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 小鼠PTD-Foxp3相关融合蛋白的表达、纯化及复性
• 3.1 材料方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 小鼠PTD-Foxp3相关融合蛋白功能的初步研究
• 4.1 材料方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 主要结论和展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文