猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株检测、分离及病毒特性的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS Virus,PRRSV）引起猪的一种新型传染病。该病自1987年首次在美国发现以来,迅速遍及世界各地。自2006年5月来,我国大部分养猪地区相继发生了“猪高热病”疫情,经证实PRRSV变异株是其重要的病原之一,给养猪业造成了巨大的损失。根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变异株Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物,以含PRRSV变异株Nsp2基因的质粒pMDNSP2及普通PRRSVVR2332株RNA为模板,建立了快速检测PRRSV变异株RT-PCR方法。通过敏感性实验、特异性实验以及临床应用实验表明该方法能够准确地鉴别PRRSV变异株和普通PRRSV,且具有快速、敏感和特异的特点,具有临床实用性。将36份经RT-PCR检测为PRRSV变异株阳性的临床样品接种Marc-145细胞,分离到5株PRRSV变异株ZZ-7、YY-8、CS06、CD06、XT07株。ZZ-7株在Marc-145细胞中的繁殖滴度较高,TCID50为10-4.63/0.1mL。对5株分离毒Nsp2、Gp5基因序列分析表明,Nsp2基因缺失情况与国内其它PRRSV变异株一致;5株分离毒Gp5基因有不同程度的变异,基因序列同源性为98.7%-99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.5%-100%。并且5株分离株位于遗传进化树同一分支上,推测它们可能源于同一个毒株。根据马动脉炎病毒（EAV）缺损性干扰（DI）RNA的特性,在PRRSV Nsp1和Nsp11基因处设计引物,在不同的PRRSV中扩增到380-1100bp的基因片段,通过对PCR产物克隆测序表明,PCR产物为PRRSV基因组片段,因此推测为PRRSV DI RNA基因片段且不同的病毒其DI RNA的组成存在差别。不同的病毒DI RNA缺失区主要在Nsp1 3′端/Nsp2 5′端至Nsp10 5′端,缺失了包括了Nsp2和Nsp10部分基因以及Nsp3-Nsp9全部基因。进一步通过制备针对PRRSV Nsp1的RNA探针对PRRSV RNA Northern杂交,结果发现在PRRSV基因组下方出现了大约6400-7000bp大小的DI RNA基因组,推测DI RNA包括5′非编码区（UTR）-Nsp1 5′端/Nsp2 5′端和Nsp10 3′端-3′未端。因此证实了在PRRSV中存在DI RNA,为PRRSV的繁殖、毒力、进化等的进一步研究打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展
• 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组及结构蛋白的研究进展
• 参考文献
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RT—PCR快速鉴别检测方法的建立与临床应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 特异性试验
• 2.2 敏感性试验
• 2.3 样品检测的应用
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离鉴定及特性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 疾病的流行情况及其症状和病变
• 2.2 病毒的分离与RT-PCR鉴定
• 2.3 间接免疫荧光（IFA）鉴定
• 2.4 PRRSV分离毒基因组序列分析
• 50的测定'>2.5 PRRSV分离毒TCID₅₀的测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒中缺损性干扰RNA的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RT-nest PCR
• 2.2 DI cDNA的克隆测序及序列分析
• 2.3 Northern blotting
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 符号说明
• 致谢
• 个人简历