转cry1Ac基因甘蔗的分子鉴定与中间试验评价

论文摘要

甘蔗是最重要的糖料作物,螟虫是我国甘蔗生产上最严重的害虫,发生普遍且具有全生长季危害的特点,蔗茎螟害率高达85%以上。甘蔗缺乏抗螟虫资源,转cry基因能有效地提高甘蔗的抗虫性,利用基因工程技术培育抗螟虫品种,是我国甘蔗产业急需解决的重要技术之一。本研究在建立环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）检测甘蔗转crylAc基因再生抗性无性系技术体系的基础上,以真实的转crylAc基因甘蔗无性系（a-1、a-2、a-3、a-4、a-5和a-6）和作为受体的非转基因对照品种福农95-1702（FN95-1702）及其组培后代（TC FN95-1702）为试验材料,通过外源基因分子检测技术鉴定了转基因真实性和遗传稳定性,围绕转基因无性系与非转基因无性系在光合特性、主要工农艺性状以及外源基因漂移到非靶标生物的情况进行研究,并对根际土壤微生物群体结构和酶学特性进行了比较。主要的研究结果和结论如下：1.针对转基因甘蔗育种、基因成分检测与监管的技术需求,本研究以转crylAc基因甘蔗为例,开发了一种基于LAMP原理,根据产物颜色,目视直观判定检测结果的有效方法。根据crylAc基因序列的6个特定区域的序列信息,设计了4条特异引物,对反应体系中Mg2+浓度、内外引物比、Bst DNA聚合酶等组分进行了优化,并对结果判定的3种方法即沉淀法、Calcein和Mn2+（Mn2+ 0.6 mmol/L,Calcein 0.05 mmol/L）络合物法、SYBR Green I法进行了比较。结果显示,所建立的LAMP技术体系,结合SYBR Green I目视法（温育前直接点在反应管盖内）,65℃温育1h即可观察结果。敏感性试验显示,优化的LAMP体系可以检测到43.1拷贝的crylAc基因重组质粒,比常规PCR灵敏度提高10倍,具有快速、灵敏、简便、高效的特点,且所需设备和结果判定简单,对检测场所也无特殊要求,不仅可作为转crylAc基因甘蔗育种和监管过程中的技术支撑,也为其他类型转基因甘蔗中基因成分检测技术的开发提供借鉴。2.针对外源crylAc基因,采用LAMP法和PCR方法,在不同生长时期,对转基因甘蔗的不同组织部位进行跟踪检测。LAMP法和PCR法相互佐证的结果显示,在所测试的6个转基因无性系共91个测试样品中,未发现目的基因crylAc在任何时期和组织部位丢失的现象,说明供试的转基因甘蔗中,外源目的基因crylAc的遗传稳定性良好。3.对转crylAc基因甘蔗和非转基因对照无性系的抗虫性和产量性状进行研究发现,与非转基因系相比,所测试的6个转基因系的抗虫性明显提高；部分转基因系的产量性状优于非转基因系,而且,主要是通过单位面积有效茎数（如转基因系a-2）或株高（如转基因系a-5）或有效茎数与株高（如转基因系a-1）的提高实现增产,说明转crylAc基因甘蔗在改良抗虫性的同时,还能获得产量和品质性状与受体相当或更好的转基因改良系。4.以转基因甘蔗中间试验基地中常见的8种禾本科杂草和其他科的5种杂草、田间主要非靶标昆虫7种和土壤微生物作为测试对象,采用特异性引物的PCR检测技术,对外源目的基因crylAc、筛选标记基因bar和nptⅡ的漂移进行了跟踪检测。结果表明,无论杂草、非靶标昆虫还是土壤微生物均不存在外源基因从转基因甘蔗漂移到所测试生物中的现象。5.通过平板培养法、BIOLOG微生物鉴定法和土壤酶活测定相结合,对转crylAc基因甘蔗根际土壤微生态安全性和土壤酶活性进行了初步研究。结果显示：转crylAc基因对土壤可培养微生物群落和酶活性存在一定的影响。对土壤微生物多样性来说,极个别品系影响了土壤微生物的多样性指数,但是整体来看,转基因对根际土壤微生物群落中微生物物种的丰富度和均度、微生物物种的优势度、微生物功能多样性的指标和群落物种多维空间上的多样性的影响是不显著的；而根际土壤中所测试的脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、磷酸酶等4种不同种类的酶活变化较为复杂,没有一致的规律性,且影响呈现不连续性和间断性,一定时期影响又会消失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 转基因抗虫作物的研究现状
• 2 cry基因家族及其利用情况
• 3 外源基因的分子检测方法
• 3.1 转基因作物的核酸检测技术
• 3.2 转基因作物的蛋白检测技术
• 4 转基因安全性评价的范畴
• 5 本研究的目的及意义
• 6 主要研究内容与技术路线
• 6.1 主要研究内容
• 6.2 技术路线
• 第二章 转crf1Ac基因甘蔗的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试植物材料与基因组DNA
• 1.2 阳性对照质粒DNA的制备与PCR检测
• 1.3 PCR引物和LAMP引物
• 1.4 LAMP体系优化
• 1.5 LAMP和常规PCR技术的敏感性检测
• 1.6 LAMP扩增产物的检测方法对比试验
• 1.7 甘蔗无性系检样的制备与LAMP和常规PCR检测
• 1.8 PCR法和LAMP法对拟转cry1Ac基因株系的分子鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒1Ac0229的获取和验证
• 2.2 LAMP检测技术体系的优化
• 2.3 LAMP和常规PCR技术的敏感性检测
• 2.4 LAMP扩增产物的不同检测方法效果比较
• 2.5 转cry1Ac基因甘蔗无性系的LAMP和常规PCR检测
• 2.6 PCR法和LAMP法对拟转cry1Ac基因株系的分子鉴定
• 2.6.1 PCR法对拟转cry1Ac基因株系的分子鉴定
• 2.6.2 LAMP法对拟转cry1Ac基因株系的分子鉴定
• 第三章 转cry基因甘蔗的光合特性及工农艺性状研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 田间试验设计
• 1.2.2 工农艺性状调查
• 1.2.3 光合特性测定
• 1.2.4 螟害情况调查
• 2 结果与分析
• 2.1 转cry1Ac基因甘蔗主要工农艺性状和净光合速率
• 2.2 转cry1Ac基因甘蔗的螟害情况
• 第四章 转cry1Ac基因甘蔗的环境安全性评价研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 田间试验设计
• 1.2.2 基因漂移研究
• 1.2.3 根际土壤微生物研究
• 1.2.4 根际土壤的酶活性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 基因漂移研究结果及分析
• 2.1.1 蔗田杂草的基因漂移研究
• 2.1.2 蔗田部分非靶标昆虫的漂移研究
• 2.1.3 蔗田土壤微生物的漂移研究
• 2.2 根际土壤微生态研究
• 2.2.1 根际土壤微生物结构多样性的研究结果
• 2.2.2 根际土壤微生物的功能多样性研究
• 2.2.2.1 转cry1Ac基因甘蔗土壤微生物群落的AWCD动态变化
• 2.2.2.2 转cry1Ac基因甘蔗对土壤微生物碳源利用的影响
• 2.3 根际土壤酶活性的研究结果及分析
• 2.3.1 转cry1Ac基因甘蔗无性系根际土壤酶活性的动态变化趋势
• 2.3.2 转cry1Ac基因对甘蔗无性系土壤酶活性影响的方差分析
• 第五章 讨论与结论
• 1 讨论
• 1.1 关于环介导等温扩增技术的建立及应用
• 1.2 关于转cry1Ac基因甘蔗分子鉴定方法和遗传稳定性
• 1.3 关于转cry1Ac基因甘蔗对产量和品质的影响问题
• 1.4 关于转cry1Ac基因甘蔗的基因漂移问题
• 1.5 关于转cry1Ac基因甘蔗种植对土壤微生态的影响问题
• 2 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 基因组DNA样品制备
• 附录2 土壤总DNA的提取
• 附录3 平板计数法用微生物培养基配方
• 附录4 主要仪器
• 附录5 常用术语缩写与中英文对照
• 致谢