漆酶高产菌株的选育及发酵条件分析

论文摘要

漆酶（Laccase）,是一种结合了多个铜离子的多酚氧化酶,在木质素降解、造纸行业中的制浆工艺和漂白工艺、纺织业、印染业、有毒物质降解以及食品行业中,有着广阔的应用前景。本文通过愈创木酚变色圈法和定性测定酶活法在食用菌以及采集的样品中筛选出漆酶酶活相对较高的菌株FA-J1,对其进行ITS rDNA鉴定,菌株归属于栓菌属。探讨了菌株FA-J1液体发酵影响因子,结果表明：碳氮源为葡萄糖、硫酸铵最适宜菌株FA-J1产酶；发酵条件为初始pH为4.5、发酵温度为28-℃、装液量60mL/250mL三角瓶的,最适宜菌株FA-J1产酶；添加0.1mmoL/LCu2+有利于菌株FA-J1产酶。探讨了菌株FA-J1固态发酵影响因子,结果表明：固体发酵原料五节芒：麸皮为6：4菌株FA-J1固态发酵产漆酶活力最高；发酵条件为含水量为70%,初始pH为6.5、发酵温度为28℃的,最适宜菌株FA-J1固态发酵产酶；添加0.15mmoL/LCu2+有利于菌株FA-J1固态发酵产酶。制备菌株FA-J1原生质体,分别采用紫外线和硫酸二乙酯诱变原生质体。紫外诱变得到一株诱变菌株UV-56,漆酶酶活提高56%,硫酸二乙酯诱变得到一株诱变菌株D52,漆酶酶活提高45%。随机扩增DNA多态性分析（RAPD）研究发现,原始菌和诱变菌在电泳图谱中,存在特异性扩增带差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 漆酶的研究现状
• 1.1 漆酶的定义
• 1.2 漆酶的结构特性
• 1.3 漆酶的催化机制
• 1.4 漆酶合成的影响因素
• 1.4.1 温度
• 1.4.2 pH值
• 1.4.3 碳源和氮源
• 1.4.4 金属离子
• 1.4.5 接种量
• 1.4.6 装液量
• 1.4.7 诱导剂
• 1.5 真菌漆酶
• 1.6 漆酶酶活测定方法
• 1.7 漆酶的应用
• 1.7.1 造纸工业中的应用
• 1.7.2 食品工业中的应用
• 1.7.3 环境保护中的应用
• 1.7.4 饲料中应用
• 2 诱变育种
• 2.1 物理因子诱变
• 2.2 化学因子诱变
• 2.2.2 核酸碱基类似物
• 2.2.3 移码突变剂
• 2.2.4 其他种类
• 3 原生质诱变技术
• 4 本研究的目的和意义及内容
• 第二章 漆酶高产菌株的筛选
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 采集样品的分离纯化
• 1.2.2 产漆酶能力初筛
• 1.2.3 产漆酶能力复筛
• 2 结果与分析
• 2.1 产漆酶的食用菌菌株的筛选
• 2.1.1 产漆酶菌株的初筛
• 2.1.2 复筛结果
• 2.2 采集的样本中产漆酶菌株的筛选
• 2.2.1 产漆酶菌株的初筛
• 2.2.2 产漆酶菌株的复筛
• 3 小结
• 第三章 菌株FA-J1分子生物学鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品和载体
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 主要分析软件
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要溶液和主要培养基
• 1.1.6 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种基因组DNA的提取
• 1.2.2 ITS rDNA基因的PCR扩增
• 1.2.3 PCR扩增产物纯化
• 1.2.4 连接反应
• 1.2.5 质粒转化
• 1.2.6 阳性克隆子菌落PCR验证
• 1.2.7 测序分析
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株基因组DNA的提取
• 2.2 TTS序列的扩增
• 2.3 菌落PCR验证结果
• 2.4 系统发育树的构建及分析
• 3 小结
• 第四章 菌株FA-J1液态发酵产漆酶条件分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂和培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 种子培养液的制备
• 1.2.2 粗酶液的制备
• 1.2.3 漆酶活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株FA-J1在产酶培养基上的产酶曲线
• 2.2 碳源对菌株发酵产酶的影响
• 2.3 氮源对菌株产酶的影响
• 2.4 培养温度对菌株产酶的影响
• 2.5 初始pH值对菌株产酶的影响
• 2+对菌株发酵产酶的影响'>2.6 添加Cu²⁺对菌株发酵产酶的影响
• 2.7 装液量对菌株发酵产酶的影响
• 3 小结
• 第五章 真菌FA-J1固态发酵产漆酶条件分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 粗酶液的制备
• 1.2.2 漆酶活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株FA-J1固态发酵产酶曲线
• 2.2 五节芒和麸皮的不同比例对产漆酶的影响
• 2.3 培养基含水量对FA-J1固体发酵产漆酶的影响
• 2.4 起始pH值对FA-J1固体发酵产漆酶的影响
• 2.5 培养温度对FA-J1固体发酵产漆酶的影响
• 2+浓度对FA-J1固体发酵产漆酶的影响'>2.6 Cu²⁺浓度对FA-J1固体发酵产漆酶的影响
• 3 小结
• 第六章 诱变育种
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要培养基和试剂
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要设备与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.0 原生质体制备与再生
• 1.2.1 原生质体诱变处理
• 1.2.2 原生质体再生菌株的初筛
• 1.2.3 原生质体再生菌株的复筛
• 1.2.4 漆酶酶活的测定
• 1.2.5 诱变菌种遗传稳定性研究
• 1.2.6 诱变菌株与出发菌株RAPD分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 原生质再生
• 2.2 原生质紫外诱变
• 2.2.1 紫外线诱变时间对原生质体致死率的影响
• 2.2.2 原生质体再生菌株有益菌株的筛选
• 2.3 原生质硫酸二乙酯（DES）诱变
• 2.3.1 硫酸二乙酯处理时间对原生质体致死率的影响
• 2.3.2 原生质体再生菌株有益菌株的筛选
• 2.4 诱变菌种遗传稳定性测定
• 2.5 诱变菌株与出发菌株RAPD分析
• 3 小结
• 第七章 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录