草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究

论文摘要

草莓（Fragaria ananassa Duch）是一种重要的小型浆果,在世界范围内广泛栽种,近年来育出很多优良品种,种植面积逐渐扩大。然而仍有很多因素限制了草莓生产的发展,其中一个重要难题就是草莓果实难以保鲜、不耐贮运。基因工程技术为植物育种、种质资源开发利用等领域开辟了新的途径,可以获得常规育种难以或无法得到的新类型。果实成熟是一个复杂的生理生化过程,而乙烯是引发果实成熟的主要因素之一。乙烯能从其生物合成和感知与信号转导两方面进行调控,相对于人们对乙烯生物合成途径的了解而言,有关植物感知乙烯及其信号转导机制的知识了解甚少,目前对乙烯信号转导的研究主要集中在拟南芥上。草莓是非跃变型果实,也能产生乙烯,某些情况下乙烯可能参与草莓的成熟,乙烯和草莓成熟之间的关系,不同的试验得出的数据彼此矛盾,目前并没有明确的结论,至今没有结果明确表明乙烯和非跃变型果实成熟的关系。乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。目前草莓上分离出3个乙烯受体基因,本试验采用反义RNA技术试图了解乙烯在草莓果实成熟衰老中的作用及这些乙烯受体的功能和作用方式。本试验对草莓组织培养体系进行了系统研究,优化了农杆菌介导的草莓遗传转化体系。构建了草莓反义乙烯受体表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2及同时含有草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS,用于转化草莓,成功的获得了转基因植株,并进行了相关分子生物学鉴定,获得反义转基因材料对探讨乙烯受体作用以及乙烯在草莓等非跃变型果实成熟的调控机理具有重要意义,也为后续研究提供了宝贵的试验材料。1.在已报道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列、FaErs1基因445bp部分特异序列和FaEtr2基因345bp部分特异序列,将上述3个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。将这4个重组表达质粒导入根癌农杆菌EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。2.以‘丰香’、‘鬼露甘’、‘全明星’、‘嫜姬’、‘哈利’、‘幸香’6个草莓品种为试材,研究了影响草莓不定芽再生的各种因素,建立离体叶片高效再生系统。结果表明,外植体基因型、植物生长调节剂种类及配比、叶龄等是影响草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘’叶片最佳芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1,‘嫜姬’叶片愈伤组织的诱导以MS+6-BA3mg·L-1+2,4-D0.2mg·L-1较好;芽伸长的最适培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1;生根的最适培养基为MS+IBA0.2mg·L-1,试管苗移栽后成活率为87%。另外,1W左右的暗培养可以防止外植体的褐化。3.利用带有内含子的gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导‘鬼露甘’草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg·L-1,可明显抑制非转化组织的生长;300mg·L-1的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。4.通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr1和FaErs1基因的双价植物表达载体pFRS导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养并经PCR和Southern blot检测证明,其中15株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr2基因的植物表达载体pBI121Etr2导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养,并经PCR和Southern blot检测证明,其中26株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr2基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因有部分的抑制。5.对转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量,呼吸强度以及叶片脱落进行了检测。相对于对照而言,转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量降低,转反义FaEtr2基因叶片乙烯释放量降低更明显。乙烯处理这些植株,叶柄脱落变缓,转反义FaEtr1和FaErs1双基因植株叶片脱落要比转FaEtr2基因植株叶片脱落慢。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 引言
• 1 乙烯
• 1.1 乙烯与果实的成熟
• 1.2 乙烯生物合成及相关酶
• 1.2.1 ACC合成酶（ACS）
• 1.2.2 ACC氧化酶（ACO）
• 1.2.3 SAM合成酶
• 1.2.4 SAM水解酶
• 2 乙烯的信号转导
• 2.1 乙烯受体与乙烯的感受
• 2.2 乙烯的胞质内信号转导
• 2.3 乙烯的核内信号转导
• 2.4 乙烯信号感受与转导模型
• 3 乙烯受体基因转基因植物的应用
• 4 草莓与乙烯
• 4.1 乙烯与草莓成熟
• 4.2 草莓的乙烯受体
• 5 草莓转基因研究进展
• 5.1 草莓抗病虫害转基因研究
• 5.2 草莓抗逆性转基因研究
• 5.3 草莓抗除草剂转基因研究
• 5.4 改善草莓品质转基因研究
• 5.5 草莓耐贮运转基因研究
• 5.6 草莓转基因中存在的问题和建议
• 6 反义RNA
• 6.1 反义RNA的作用机理
• 6.2 反义RNA技术
• 6.3 反义RNA在果实成熟调控中的应用
• 6.3.1 多聚半乳糖醛酸酶（PG）反义基因工程研究进展
• 6.3.2 果胶酯酶（PE）反义基因工程研究进展
• 6.3.3 ACC合成酶反义基因的应用
• 6.3.4 乙烯形成酶反义基因的应用
• 6.3.5 乙烯受体反义基因的应用
• 7 本项目的研究内容
• 8 本项目研究的意义
• 第一章 草莓乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 酶与化学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 目的片段的克隆
• 1.2.1.1 草莓总RNA的提取
• 1.2.1.2 第一链cDNA的合成
• 1.2.1.3 引物设计
• 1.2.1.4 PCR产物的回收
• 1.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.1.6 目的片段T载体的连接,转化及鉴定
• 1.2.1.7 大肠杆菌质粒的提取
• 1.2.2 植物表达载体构建和鉴定
• 1.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备,转化及质粒提取
• 1.2.2.2 质粒的限制性酶切反应
• 1.2.2.3 反义乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2表达载体的构建
• 1.2.2.4 含反义乙烯受体FaEtr1和FaErs1双价表达载体的构建
• 1.2.2.5 表达载体的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 草莓RNA的提取
• 2.2 草莓FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因克隆
• 2.3 植物反义表达载体的构建及重组子的鉴定
• 2.4 外源基因整合检测
• 3 讨论
• 第二章 草莓高频离体再生体系的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试试材
• 1.2 培养基与植物生长调节剂
• 1.2.1 不定芽诱导
• 1.2.2 不定芽伸长
• 1.2.3 不定芽生根
• 1.3 其他因素设计
• 1.4 培养条件
• 1.5 数据调查
• 2 结果和分析
• 2.1 叶盘再生芽的生长动态
• 2.2 外植体和外植体培养方式对不定芽诱导的影响
• 2.3 叶龄对叶片不定芽诱导率的影响
• 2.4 基因型对叶片不定芽诱导率的影响
• 2.5 暗培养对叶片不定芽诱导率的影响
• 2.6 不同植物生长调节剂配比对不定芽分化的影响
• 2.7 不同植物生长调节剂配比对不定芽伸长的影响
• 2.8 不同植物生长调节剂配比对不定芽生根的影响
• 2.9 试管苗的移植
• 3 讨论
• 第三章 根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 转化受体材料
• 1.2 供试菌株
• 1.3 培养基及培养条件
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 抗生素敏感性试验
• 1.4.2 试管苗叶片状态试验
• 1.4.3 工程菌液的制备
• 1.4.4 预培养时间、侵染时间、共培养时间和菌液浓度的优化
• 1.4.5 遗传转化
• 1.4.6 gus瞬时表达检测
• 1.5 PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 抗生素敏感性试验
• 2.2 试管苗叶片状态试验
• 2.3 预培养时间对转化的影响
• 2.4 菌液浓度对转化的影响
• 2.5 侵染时间对转化的影响
• 2.6 共培养时间对转化的影响
• 2.7 转化植株再生与分子检测
• 3 讨论
• 第四章 反义乙烯受体基因转化材料的获得及检测
• 1 材料与方法
• 1.1 转化材料及培养条件
• 1.2 农杆菌对草莓叶盘的转化和再生
• 1.3 草莓DNA的提取及酶切
• 1.3.1 方法一:CTAB法提取草莓DNA
• 1.3.1.1 试剂
• 1.3.1.2 方法
• 1.3.2 方法二:试剂盒提取
• 1.3.3 DNA的酶解检测
• 1.4 转基因植株的PCR检测
• 1.5 转基因植株的SOUTHERN印迹杂交检测
• 1.5.1 杂交相关溶液
• 1.5.2 样品制备
• 1.5.3 Southern转膜
• 1.5.4 探针标记
• 1.5.5 探针效率检测
• 1.5.6 预杂交
• 1.5.7 杂交
• 1.5.8 杂交后洗膜
• 1.5.9 显色反应
• 1.6 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测
• 1.6.1 杂交相关试剂及其配制
• 1.6.2 RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳
• 1.6.3 印迹
• 2 结果与分析
• 2.1 草莓DNA的提取及酶切
• 2.2 转化及抗性苗的获得
• 2.3 转基因植株的PCR检测
• 2.4 转基因植株的SOUTHERN杂交检测
• 2.5 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测
• 3 讨论
• 第五章 转反义乙烯受体基因草莓乙烯合成特性相关研究
• 1 材料与方法
• 1.1 乙烯测定方法
• 1.2 叶片脱落试验
• 1.2.1 乙烯处理方法
• 1.2.2 1-MCP处理方法
• 1.3 呼吸强度测定
• 2 结果与分析
• 2.1 乙烯释放量的变化
• 2.2 叶片脱落试验
• 2.3 呼吸强度的变化
• 3 讨论
• 总结及后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 读博期间发表的相关文章