瓠瓜EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反应体系的建立及其纯度鉴定应用的研究

论文摘要

瓠瓜（Lagenaria culgaris Ser.）是一种重要的蔬菜,营养丰富,有较好的保健功能。对瓠瓜杂种鉴定的研究,有利于种子市场的管理、瓠瓜种质收集与保存,对保护新品种的知识产权和育种家们的权益具有重要意义。本研究采用EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD4种分子标记技术,在优化反应体系的基础上,建立瓠瓜杂种纯度室内快速鉴定技术体系。主要研究结果如下:1.在前人研究的基础上,借鉴其他葫芦科作物的研究成果,利用正交试验设计和单因素试验相结合的方法优化EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反应体系及扩增程序,摸索出一套适合于瓠瓜杂种鉴定的EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反应体系。各分子标记的最佳反应体系及程序如下:（1）优化后的EST-SSR反应体系:10μl反应体系中,TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、Mg2+4种主要成分的最适浓度分别为:0.5U、0.1μmol/L、100μmol/L和0.75mmol/L。（2）优化的SRAP反应体系（20μl）,TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5种主要成分的最适浓度分别为:1.25U、30ng、0.5μmol/L、100μmol/L、2mmol/L。在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下检测结果,稳压120V。（3）优化后的ISSR反应体系:在20μl的反应体系中,TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5种主要成分的最适浓度分别为:0.5U、40ng、0.75μmol/L、150μmol/L、2mmol/L。最佳扩增程序为:94℃预变性5min;92℃变性30s:58℃退火45s;72℃延伸1.5min;循环35次;最后72℃延伸7min;4℃保存,在1.8%的琼脂糖凝胶电泳上检测扩增结果。（4）优化后的RAPD反应体系:在20μl的反应体系中,TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5种主要成分的最适浓度分别为:1U、30ng、1.5ng/μl、150μmol/L和1.75mmol/L2.56对甜瓜属、54对黄瓜属和10对苦瓜属EST-SSR引物对3个杂交种及亲本没有扩增出多态性;市场上购买的9个瓠瓜品种及本实验室培育的3个杂交种（06-2×06-6、06-4×06-5、06-1×06-5）之间有两对引物扩增出多态性,可以区分3个品种。3.本实验从12对引物组合中没有筛选出可以鉴别3个杂交种及亲本的有效引物对,但12对SRAP引物组合中有4对引物组合（em2/me6、em3/mel、em3/me2、em5/me2）在本实验室的3个杂交种（06-2×06-6、06-4×06-5、06-1×06-5）和购买的9个瓠瓜品种之间扩增出多态性,共扩增出46条带,20条多态性条带,多态性比率达43.48%。4对引物组合可将市场购买的9个瓠瓜品种完全区分开,并且除2号品种外的其他8个品种可以与本实验室的3个杂交种区分开。4.24条ISSR引物,在3个杂交组合及亲本和购买的9个瓠瓜品种之间没有扩增出多态性。5.本实验从186条RAPD随机引物中筛选出9条引物用于3个瓠瓜杂交种的纯度鉴定。其中组合06-2×06-6,获得2条偏母型引物和2条缺失型引物;组合06-1×06-5,获得3条偏父型引物和2条缺失型引物;组合06-4×06-5,获得4条偏母型和1条偏父型引物。6.综合4种标记的分析结果,RAPD和SRAP标记更适合瓠瓜的杂种鉴定。所以可以将RAPD和SRAP两种标记结合使用,利用SRAP技术的分辨率高、稳定性强和RAPD技术的操作简单、灵敏度高的特点,提高了结果的可靠性,以及分子标记用于瓠瓜杂种鉴定上的可行性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1.文献综述
• 1.1 杂种纯度鉴定方法的发展历程
• 1.1.1 形态鉴定
• 1.1.2 物理化学鉴定
• 1.1.3 指纹图谱鉴定
• 1.1.3.1 生化指纹图谱
• 1.1.3.1.1 蛋白质电泳技术
• 1.1.3.1.2 同工酶电泳技术
• 1.1.3.2 DNA指纹图谱
• 1.1.3.2.1 RFLP标记
• 1.1.3.2.2 RAPD及其相关标记
• 1.1.3.2.3 AFLP标记
• 1.1.3.2.4 SSR标记
• 1.1.3.2.5 EST-SSR标记
• 1.1.3.2.6 ISSR标记
• 1.1.3.2.7 SRAP标记
• 1.2 指纹图谱技术在部分葫芦科蔬菜杂种纯度和真伪鉴定中的应用
• 1.2.1 黄瓜的相关研究
• 1.2.2 西瓜的相关研究
• 1.2.3 甜瓜的相关研究
• 1.2.4 其他瓜类的相关研究
• 1.3 分子标记技术在葫芦科作物纯度和真伪鉴定中的问题和应用前景
• 1.3.1 存在的问题
• 1.3.2 应用前景
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.4.1 研究的意义
• 1.4.2 研究目的
• 2.EST-SSR标记技术鉴定瓠瓜品种的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 瓠瓜材料
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 杂交组合的配制
• 2.2.2 田间试验设计
• 2.2.3 DNA提取及质量检测方法
• 2.2.3.1 DNA的提取
• 2.2.3.2 DNA的检测
• 2.2.4 EST-SSR标记PCR反应优化设计
• 2.2.4.1 PCR反应体系的优化
• 2.2.4.2 引物的筛选
• 2.2.4.3 EST-SSR-PCR扩增程序
• 2.2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3 结果
• 2.3.1 EST-SSR反应体系的优化
• 2.3.2 甜瓜、黄瓜EST-SSR标记在瓠瓜上的通用性
• 2.3.3 EST-SSR多态性引物的筛选及多态性分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 EST-SSR反应稳定性及影响因素
• 2.4.2 EST-SSR标记在瓠瓜杂种鉴定上的应用
• 3.SRAP标记技术鉴定瓠瓜品种的研究
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 PCR反应体系的优化和建立
• 3.2.1.1 正交试验
• 3.2.1.2 单因素试验
• 3.2.2 引物的筛选
• 3.2.3 PCR扩增程序
• 3.2.4 扩增产物检测技术的优化和建立
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SRAP反应体系的优化
• 3.3.1.1 正交试验结果分析
• 3.3.1.2 单因素试验结果分析
• 3.3.1.2.1 DNA模板用量
• 2+用量'>3.3.1.2.2 Mg²⁺用量
• 3.3.1.2.3 dNTPs用量
• 3.3.1.2.4 TaqDNA聚合酶用量
• 3.3.1.2.5 引物用量
• 3.3.1.2.6 SRAP-PCR扩增反应体系的确立
• 3.3.2 扩增产物检测技术的优化和建立
• 3.3.3 多态性引物的筛选及其多态性分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 SRAP反应稳定性及影响因素
• 3.4.2 正交试验设计和单因素试验在PCR反应体系优化上的比较
• 3.4.3 SRAP标记在瓠瓜杂种鉴定上的应用
• 4.ISSR标记技术鉴定瓠瓜品种的研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 PCR反应体系优化设计
• 4.2.2 引物的筛选
• 4.2.3 PCR扩增程序的优化
• 4.2.4 扩增产物检测技术的优化和建立
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 ISSR反应体系的优化
• 4.3.1.1 DNA模板用量对ISSR-PCR的影响
• 2+浓度对ISSR-PCR的影响'>4.3.1.2 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR的影响
• 4.3.1.3 dNTPs用量对ISSR-PCR的影响
• 4.3.1.4 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR的影响
• 4.3.1.5 引物用量对ISSR-PCR的影响
• 4.3.1.6 优化后的反应体系
• 4.3.2 扩增程序的优化
• 4.3.3 扩增产物检测技术的优化和建立
• 4.3.4 多态性引物的筛选及其多态性分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 ISSR反应稳定性及影响因素
• 4.4.2 ISSR标记在瓠瓜杂种鉴定上的应用
• 5.RAPD标记技术鉴定瓠瓜品种的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 瓠瓜材料
• 5.1.2 引物
• 5.1.3 试剂及仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 RAPD标记PCR反应优化设计
• 5.2.1.1 PCR反应体系的优化
• 5.2.1.2 引物的筛选
• 5.2.1.3 PCR扩增程序
• 5.2.1.4 琼脂糖凝胶电泳
• 5.3 结果
• 5.3.1 RAPD反应体系的优化
• 2+浓度对RAPD-PCR反应体系的影响'>5.3.1.1 Mg²⁺浓度对RAPD-PCR反应体系的影响
• 5.3.1.2 DNA模板用量对RAPD-PCR的影响
• 5.3.1.3 RAPD-PCR最佳反应体系的建立
• 5.3.2 RAPD多态性引物的筛选及多态性分析
• 5.3.3 DNA指纹图谱类型的建立
• 5.4 讨论
• 5.4.1 RAPD反应稳定性及影响因素
• 5.4.2 RAPD标记在瓠瓜杂种鉴定上的应用
• 5.4.3 瓠瓜杂种鉴定的分子标记选择问题
• 6.结论
• 6.1 四种分子标记最佳反应体系的建立
• 6.2 四种分子标记多态性引物分析
• 6.3 几种分子标记技术在瓠瓜杂种鉴定上的优劣比较
• 参考文献
• 附录
• 致谢