Mineirao柱花草抗炭疽病候选基因MSRA的克隆及其序列分析

论文摘要

柱花草（Stylosanthes spp.）是一种优良的热带豆科牧草,原产于中南美洲、北美洲、非洲及东南亚和印度。目前,柱花草已在我国华南热带、亚热带地区进行了大面积种植和推广。然而,柱花草炭疽病的发生和流行限制了柱花草的进一步利用。Mineirao柱花草是一种高度抗炭疽病的品种,已在巴西得到了大面积的推广种植,但其抗病机理尚不清楚。有关研究人员已经对Mineirao柱花草的抗病机理进行了初步研究,并用AFLP分子标记技术从其基因组DNA中获得了一特异片断SG2950-1,经分析,该片断可能是抗炭疽病某一候选基因上的一个中间片断。本论文通过对提取植物组织RNA的CTAB法进行改进,从柱花草叶片中提取得到了高质量的总RNA,成功建立了柱花草叶片总RNA的提取方法。然后根据SG2950-1设计特异引物,利用RT-PCR法结合RACE技术,获得了基因的全长cDNA序列,该序列包含一个长度为1563 bp的开放阅读框,命名为MSRA基因。其推导的氨基酸序列与烟草细胞色素P450一氧化酶有64%的同源性,其预测的蛋白质性质与分子量以及跨膜区等也均与细胞色素P450酶相近,因此,初步预测该基因可能与抗炭疽病有关,但其功能尚待进一步验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 柱花草的重要性
• 1.2 柱花草炭疽病研究进展
• 1.2.1 柱花草炭疽病的主要危害
• 1.2.2 柱花草炭疽病原菌的遗传多态性及流行性研究
• 1.3 柱花草抗炭疽病育种进展
• 1.3.1 收集柱花草种质资源培育抗病品种
• 1.3.2 引种选育
• 1.3.3 辐射育种
• 1.3.4 杂交育种
• 1.3.5 细胞工程育种
• 1.3.6 转基因抗病育种
• 1.4 柱花草生物学研究
• 1.4.1 柱花草细胞遗传学研究
• 1.4.2 柱花草细胞生物学研究
• 1.5 柱花草生物技术研究
• 1.5.1 柱花草组织培养
• 1.5.2 柱花草的原生质融合
• 1.5.3 柱花草遗传转化
• 1.5.4 柱花草分类及分子标记
• 1.5.5 柱花草基因克隆
• 1.6 基因克隆技术进展
• 1.6.1 根据特异蛋白分离目的基因
• 1.6.2 利用核酸探针克隆目的基因
• 1.6.3 基于分子标记技术分离目的基因
• 1.6.4 根据特异mRNA 分离目的基因
• 1.6.5 利用DNA 插入法分离目的基因
• 1.6.6 染色体步行法分离目的基因
• 1.6.7 表达序列标签法分离目的基因
• 1.6.8 基因表达系列分析法
• 1.6.9 酵母双杂合系统
• 1.6.10 利用基因芯片技术克隆新基因
• 1.6.11 RACE 技术
• 1.7 本研究的目的和意义
• 1.8 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌种和质粒
• 2.3 培养基
• 2.4 生化试剂
• 2.5 已知DNA 片断SG2950-1（蒋昌顺，2005）
• 2.6 引物
• 2.7 主要仪器和设备
• 2.8 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 的提取
• 2.9 已知片断SG2950-1 的CDNA 克隆
• 2.9.1 反转录生成cDNA 第一链
• 2.9.2 反转录产物的检测
• 2.9.3 PCR 反应
• 2.9.4 RT-PCR 产物的切胶回收
• 2.9.5 克隆片断连接T 载体
• 2.9.7 连接产物转化E. coil JM 109 感受态细胞
• 2.9.8 重组质粒的鉴定
• 2.9.9 测序及序列分析
• 2.10 MSRA 基因3′端未知序列的克隆
• 2.10.1 所用引物
• 2.10.2 反转录生成cDNA 第一链
• 2.10.3 PCR 反应
• 2.10.4 将PCR 产物克隆至载体进行测序分析
• 2.11 MSRA 基因5′端未知序列的克隆
• 2.11.1 所用引物
• 2.11.2 反转录生成cDNA 第一链反应
• 2.11.3 反转录产物的加A 反应
• 2.11.4 PCR 反应
• 2.11.5 将PCR 产物克隆至T-载体进行测序分析
• 2.12 MSRA 基因全长 CDNA 序列的 RT-PCR 克隆
• 2.12.1 引物的设计
• 2.12.2 PCR 反应
• 2.12.3 将PCR 产物克隆至T-载体进行测序分析
• 2.13 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 质量分析
• 3.2 反转录CDNA 的质量检测
• 3.3 MSRA 基因的克隆
• 3.3.1 Mineirao 柱花草中已知片断 SG2950-1 的cDNA 克隆
• 3.3.2 MSRA 基因的cDNA 3′端未知序列的克隆
• 3.3.3 MSRA 基因的cDNA 5′端未知序列的克隆
• 3.3.4 3 个片段的cDNA 序列（MSRA-1，MSRA-3′，MSRA-5′）的拼接及其拼接序列的分析
• 3.3.5 MSRA 基因cDNA 全长序列的克隆
• 3.4 MSRA 基因所推导的氨基酸序列的功能预测
• 3.4.1 MSRA 基因所推导的氨基酸序列的同源性比较
• 3.4.2 MSRA 基因的蛋白质理化性质分析
• 3.4.3 跨膜区预测
• 3.4.4 MSRA 基因的氨基酸序列的二级结构预测
• 4 讨论
• 4.1 MINEIRAO 柱花草叶片总RNA 的提取
• 4.2 MSRA 基因的克隆
• 4.3 细胞色素P450 酶系的存在和基本功能
• 4.3.1 细胞色素P450 酶系存在的普遍性
• 4.3.2 植物细胞色素P450 酶系的基本功能
• 4.3.3 植物细胞色素P450 酶系的可诱导性
• 5 结论
• 参考文献
• 缩略词（ABBREVIATION）
• 附录：硕士期间发表论文情况
• 致谢