siRNA特异性抑制水通道蛋白-1基因在人羊膜WISH细胞的表达

论文摘要

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升高。但羊水平衡的分子机制仍不清楚。目前研究认为羊水膜内转运吸收是维持羊水稳态平衡的重要方式,但其分子机制尚不清楚。水通道蛋白（Aquanproin, AQP）是一族介导水跨膜转运的膜孔蛋白,在机体内器官的液体平衡中发挥着关键作用,但其在羊水平衡中的作用机理还不清楚。RNA干扰技术是近年来用于哺乳动物细胞培养研究的新方法,用以使目的基因表达沉默,进而分析其功能。人羊膜WISH细胞株源于正常足月妊娠的人羊膜上皮细胞。为了研究AQP在母胎液体平衡的作用,建立研究羊膜AQPs在羊水量平衡中作用及其调节机制的细胞模型,本研究应用RNA干扰技术研究特异性siRNA（small interference RNA）对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用。结果如下:1.本研究运用RT-PCR和细胞免疫荧光化学技术,检测人羊膜WISH细胞中AQP1, 3, 8, 9的表达,结果表明AQP1, 3, 8, 9在人羊膜上皮WISH细胞均有表达,AQP1, 3, 8, 9 mRNA的表达水平分别约为0.489±0.103, 0.594±0.093, 0.474±0.136, 0.425±0.150（ x±S）。细胞免疫荧光技术在蛋白水平显示AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞表达。结论认为,WISH细胞可以作为研究羊膜水通道蛋白对水转运及调控机制的细胞模型。2.本研究运用0 nmol/L, 5 nmol/L, 10 nmol/L, 20 nmol/L和30 nmol/L CY3-Negative siRNA转染人羊膜上皮WISH细胞,以确定其转染效率。转染后24 h,荧光显微镜观察细胞内可见红色荧光,而对照组未见到荧光信号,说明化学合成siRNA可以被有效转入细胞,荧光为特异性荧光信号。流式细胞仪检测转染效率分别为:0, 7.7%, 39.35%, 87.27%和95.78%;20 nmol/L和30 nmol/L转染组的转染效率显著高于5 nmol/L和10 nmol/L组（P<0.05）;20 nmol/L和30 nmol/L组转染效率无显著差异（P>0.05）。运用20 nmol/L的Negative siRNA转染细胞24 h后,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测转染对细胞凋亡的影响,结果转染组和对照组细胞早期凋亡率分别为1.96%和2.36%,两组之间细胞凋亡率无显著差异（P>0.05）。结论认为,20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果;转染效率随siRNA浓度增加而升高;化学合成siRNA转染对细胞凋亡无明显影响。3.本研究应用化学合成的3条不同序列AQP1-siRNA,终浓度均为20 nmol/L,分别转染细胞24 h,筛选抑制效率最高的siRNA,结果表明AQP1-siRNA-1抑制作用最强;然后分别应用20 nmol/L, 40 nmol/L, 60 nmol/L和80 nmol/L的AQP1-siRNA-1转染细胞,研究不同浓度的siRNA对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用;转染24 h后荧光定量PCR检测,结果各组AQP1 mRNA的表达水平分别降低20.42%, 39.86%, 60.34%和65.81%;阴性对照组AQP1 mRNA表达为空白组的95.7%,与空白对照组无显著性差异（P>0.05）。4.本研究运用60 nmol/L AQP1-siRNA-1转染细胞,转染分别培养24 h, 48 h和72 h,研究siRNA的有效作用时间。荧光定量PCR检测结果发现,各组AQP1 mRNA分别较空白组下调60.24%, 90.57%, 87.68%。以48 h转染组AQP1 mRNA表达降低最为显著（P<0.01）;阴性对照组和空白组无表达差异（P>0.05）。结论认为,siRNA对AQP1 mRNA表达的抑制作用在24 h72 h呈时间依赖性升高,最大抑制作用在48 h,有效抑制时间达72 h。总之,本研究检测了AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞的表达,优化了siRNA转染WISH细胞的条件,筛选出有效抑制AQP1 mRNA表达的siRNA序列;最后应用AQP1-siRNA成功抑制了WISH细胞AQP1 mRNA表达,建立了AQP1基因沉默的羊膜上皮细胞模型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 水通道蛋白在母胎液体平衡中的作用研究
• 1.1 水通道蛋白家族
• 1.1.1 AQPs 的重要性
• 1.1.2 AQPs 的发现、命名及分类
• 1.1.3 AQPs 的结构
• 1.2 AQPs 在母胎液体交换中的生理作用
• 1.2.1 母胎液体交换与羊水平衡途径
• 1.2.2 AQPs 在胎盘胎膜组织的表达
• 1.2.3 羊水量异常与AQPs 表达的关系
• 1.2.4 AQPs 的调节
• 第二章 RNA 干扰技术及其应用的研究
• 2.1 RNAi 的发现简史
• 2.2 RNAi 的作用机制
• 2.2.1 转录水平基因沉默
• 2.2.2 转录后基因沉默
• 2.2.3 翻译水平基因沉默
• 2.3 RNAi 的实现方法
• 2.3.1 体外制备
• 2.3.2 体内表达
• 2.4 RNAi 的应用
• 2.4.1 细胞信号传导途径分析
• 2.4.2 基因功能检测
• 2.4.3 基因敲除和基因沉默
• 2.4.4 基因治疗
• 2.4.5 药物开发
• 2.5 结语
• 试验研究
• 第三章 AQP1, 3, 8, 9 在人羊膜WISH 细胞的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 研究对象
• 3.1.2 主要试剂及药品
• 3.1.3 试剂配制
• 3.1.4 主要器械及仪器设备
• 3.1.5 细胞培养
• 3.1.6 RT-PCR 检测WISH 细胞AQP1, 3, 8, 9 m RNA 的表达
• 3.1.7 免疫荧光细胞化学法检测AQP1, 3, 8, 9 蛋白的表达
• 3.1.8 结果的分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 细胞总RNA 鉴定
• 3.3.2 RT-PCR 检测结果
• 3.2.3 细胞免疫荧光检测结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 siRNA 转染人羊膜WISH 细胞的效率检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 研究对象
• 4.1.2 主要试剂及药品
• 4.1.3 主要器械及仪器设备
• 4.1.4 人羊膜WISH 细胞的培养
• 4.1.5 siRNA 转染和转染效率检测
• 4.1.6 细胞凋亡检测
• 4.1.7 统计学分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 荧光显微镜观察
• 4.2.2 流式细胞仪检测转染效率
• 4.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 siRNA 对AQP1 基因在人羊膜WISH 细胞表达的抑制
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 研究对象
• 5.1.2 主要试剂及药品
• 5.1.3 主要器械及仪器设备
• 5.1.4 细胞培养及试验分组
• 5.1.5 转染
• 5.1.6 Real time-PCR 检测
• 5.1.7 统计学分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 siRNA 序列的筛选
• 5.2.2 不同浓度AQP1-siRNA 转染后细胞AQP1 mRNA 的表达
• 5.2.3 AQP1-siRNA 转染后不同时间细胞AQP1 mRNA 的表达
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介