论文摘要
第一部分:慢性肾衰竭大鼠反复注射静脉铁剂致氧化应激反应的研究研究背景和目的贫血是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）常见的临床表现和并发症,贫血增加CKD患者心血管疾病等并发症导致患者死亡率升高。肾性贫血最主要的原因是绝对或相对的促红细胞生成素缺乏,缺铁、慢性失血、炎症、红细胞寿命缩短等一些因素也参与了贫血的发生。CKD患者贫血时缺铁非常普遍,尤其是在红细胞生成刺激剂（erythropoiesis-stimulating agents,ESA）治疗期间更易发生。大量的研究已经证实了静脉铁剂的疗效和短期安全性,静脉铁剂已成为ESA治疗肾性贫血时的重要辅助药物。但是不少研究报导静脉补铁能加剧体内的氧化应激及微炎症状态,引起脂质、蛋白质、核酸分子以及组织损伤。氧化应激产物如过氧化低密度脂蛋白（OxLDL）通过促进泡沫细胞、脂纹形成以及损伤血管内皮功能参与动脉粥样硬化的发生、发展。目前,临床上常用的静脉铁剂主要是铁的各种碳水化合物制剂,如低分子右旋糖酐铁（low weight iron dextran）、蔗糖铁（iron sucrose）以及葡萄糖酸亚铁（iron gluconate）,前两种铁剂在我国已经上市。急性实验研究发现静脉铁剂可以使机体氧化应激产物如MDA水平一过性显著升高,多数在短时间内（24h左右）恢复,并且不同铁剂引起的氧化应激存在明显差异。关于不同静脉铁剂重复多次给药后对慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）机体氧化应激的影响目前报道较少。本实验以5/6肾大部切除大鼠为模型,观察两种常用静脉铁剂小剂量低分子右旋糖酐铁和蔗糖铁10次静脉补铁后CRF大鼠体内氧化应激状态的变化,为进一步了解铁剂治疗肾性贫血时的氧化应激及其干预提供一定的实验依据。方法选用6周龄体重200-230g雄性SD大鼠,二步法5/6肾大部切除术建立慢性肾衰竭大鼠模型。大鼠右肾切除术后第4周,将符合条件的慢肾衰大鼠随机分为3组:低分子右旋糖酐铁组（10mg/kg+生理盐水稀释至0.4ml,每周周一、周四尾静脉注射两次,共5周,n=6）、蔗糖铁组（10mg/kg+生理盐水稀释至0.4ml,每周周一、周四尾静脉注射两次,共5周,n=6）、CRF对照组（给予同等体积的生理盐水尾静脉注,n=6）,同时以假手术组为正常对照组（Sham组,n=6）。观察6周,比较各组大鼠肾功能、尿蛋白、血常规、铁代谢指标、血和组织氧化应激指标以及组织病理变化等差异。结果1.CRF对照组、低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组3组大鼠肾脏切除比例、基线血清肌酐和尿素氮、尾动脉收缩压、尿蛋白/肌酐比值、血红蛋白、红细胞压积及体重无显著差异（P＞0.05）;蔗糖铁组大鼠从注射铁剂第3周开始体重显著低于CRF对照组（P＜0.05）和低分子右旋糖酐铁组（P＜0.05）;实验终点时,3组CRF大鼠的尾动脉收缩压、血清肌酐和尿素氮、尿蛋白/肌酐比值无统计学差异（P＞0.05）;低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组每只大鼠平均补铁剂量无统计学差异（P＞0.05）。2.静脉铁剂组大鼠血红蛋白、红细胞压积明显高于CRF对照组（P＜0.05）,低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组之间无显著性差异（P＞0.05）。3.CRF对照组大鼠的血清铁、血清铁蛋白、转铁蛋白显著低于Sham组（P＜0.05）;静脉补铁后,CRF大鼠铁状态指标较CRF对照组显著改善,低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组大鼠血清铁、血清总铁结合力、转铁蛋白饱和度、血清铁蛋白以及转铁蛋白水平显著高于CRF对照组（P＜0.01）,蔗糖铁组和低分子右旋糖酐铁组之间无统计学差异（P＞0.05）。4.3组CRF大鼠的血清SOD、CAT及TAOC水平均较Sham升高（P＜0.05）,低分子右旋糖酐铁组、蔗糖铁组和CRF对照组三组之间大鼠血清SOD及TAOC水平无显著性差异（P＞0.05）;铁剂治疗组血清CAT水平高于CRF对照组（P＜0.05）;CRF大鼠血浆GSH-Px水平较Sham组大鼠显著降低（P＜0.05）,蔗糖铁组显著低于低分子右旋糖酐铁组和CRF对照组（P＜0.01）,低分子右旋糖酐铁组与CRF对照组之间无统计学差异（P=0.519）。5.CRF对照组血浆AOPP明显高于Sham组（81.83±19.93 vs 40.12±14.98μmol/L,P＜0.01）,低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组显著高于CRF对照组（127.84±21.19 vs 134.21±29.38 vs 81.83±19.93μmol/L,P＜0.05）,低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组之间没有统计学差异（127.84±21.19 vs134.21±29.38μmol/L,P＞0.05）。6.3组CRF大鼠血浆MDA均显著高于Sham组（P＜0.01）,低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组血浆MDA水平高于CRF对照组,蔗糖铁组血浆MDA水平高于低分子右旋糖酐铁组（蔗糖铁组vs低分子右旋糖酐铁组vs CRF对照组vsSham组,6.06±0.73 vs 4.99±0.80 vs 2.53±0.18 vs 1.19±0.38 nmol/L,P＜0.05）。7.CRF对照组、低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组3组大鼠肾脏病理改变相似,肾小球硬化指数和小管间质纤维化评分的比较无统计学差异（P＞0.05）。8.两组静脉铁剂大鼠肾皮质、肝组织MDA水平显著高于Sham组和CRF对照组（P＜0.05）,低分子右旋糖酐铁组、蔗糖铁组之间以及Sham组和CRF对照组之间无统计学差异（P＞0.05）;蔗糖铁组大鼠左室心肌组织MDA水平较Sham组显著升高（P＜0.05）;3组CRF大鼠肾脏皮质组织、肝组织总SOD活性均低于Sham组（P＜0.01）,3组之间无统计学差异（P＞0.05）;CRF对照组大鼠肾皮质的GSH-Px活性显著高于Sham组、低分子右旋糖酐铁组和蔗糖铁组（P＜0.05）,蔗糖铁组GSH-Px活性也显著高于低分子右旋糖酐铁组（P＜0.05）。蔗糖铁组大鼠肝脏组织的GSH-Px活性显著低于CRF对照组和低分子右旋糖酐铁组（P＜0.05）,低分子右旋糖酐铁组和CRF对照组无显著性差异（P＞0.05）。结论1.5/6肾大部切除的CRF模型大鼠在右肾切除后4-10周内,出现显著的肾功能损害、贫血、血压升高等改变,并且肾功能损害、尿蛋白排泄等相对保持稳定,与既往研究一致;2.5/6肾大部切除的CRF大鼠存在缺铁性贫血,单纯静脉补充铁剂可以部分纠正贫血状态,改善铁代谢指标;3.两种静脉铁剂反复注射后可以引起CRF大鼠的血MDA、AOPP显著升高、GSH-Px降低等氧化应激异常,血SOD、CAT及TAOC的升高可能是机体的代偿产生;4.不同静脉铁剂致氧化应激的能力存在一定差异,本部分实验发现蔗糖铁对CRF大鼠的血MDA、GSH-Px以及肾组织MDA、肝组织GSH-Px等氧化应激指标的不利影响比低分子右旋糖酐铁明显;5.尽管存在氧化应激改变,实验中铁剂治疗组的肾功能、尿蛋白排泄、肾脏病理等相关指标无显著差异。第二部分:慢性肾衰竭大鼠静脉铁剂不同给药策略致氧化应激反应的研究研究背景和目的目前临床主要存在两种静脉补铁策略,即单次总剂量（Total dose infusion,TDI）补铁和小剂量多次补铁。我们在第一部分研究中已经证实5/6肾大部切除大鼠给予反复小剂量多次静脉铁剂后存在着明显的氧化应激反应,但单次总剂量补铁和小剂量多次补铁这两种静脉补铁策略对于CRF时机体氧化应激及损伤影响的比较尚未见报道。目前,K/DOQI仅推荐右旋糖酐铁可以进行总剂量给药,因此,本部分实验通过观察低分子右旋糖酐铁单次总剂量静脉补铁和小剂量多次补铁共6周后CRF大鼠体内氧化应激状态的变化,来了解目前两种静脉补铁策略对于机体氧化应激的差异,为铁剂治疗肾性贫血时方法的选择及静脉补铁时氧化应激的干预提供一定的实验资料和依据。方法选用6周龄体重200-230g的雄性SD大鼠,二步法5/6肾大部切除术建立慢性肾衰竭大鼠模型。右肾切除术后第4周,将符合条件的慢性肾衰大鼠随机分为3组:静脉铁剂总剂量给药组（科莫非100mg/kg一次性尾静脉注射,后给予0.4ml生理盐水每周一、周四分别注射两次,共9次;n=6）、静脉铁剂小剂量多次给药组(给予科莫非10mg/kg（生理盐水稀释至相同体积,每周的周一、四尾静脉注射两次,共5周10次,n=6）、CRF对照组（给予同等体积的生理盐水尾静脉注,n=6）,同时以假手术组（Sham组,n=6）为正常对照组。观察6周,比较各组大鼠肾功能、尿蛋白、血常规、铁代谢指标、血和组织氧化应激指标以及组织病理变化等差异。结果1.CRF对照组、总剂量给药组和小剂量多次给药组3组大鼠肾脏切除比例、基线血清肌酐和尿素氮、尾动脉收缩压、尿蛋白/肌酐比值、血红蛋白、红细胞压积及体重无显著差异（P＞0.05）;实验终点时,慢性肾衰组大鼠的尾动脉收缩压、血清肌酐和尿素氮、尿蛋白/肌酐比值无统计学差异（P＞0.05）;小剂量多次给药组和总剂量给药组大鼠平均总补铁剂量无统计学差异（P＞0.05）。2.铁剂总剂量给药组和小剂量多次给药组大鼠血红蛋白、红细胞压积显著高于CRF对照组（P＜0.05）,静脉铁剂组之间无显著性差异（P＞0.05）。3.CRF对照组大鼠血清铁显著低于Sham组（P＜0.05）,小剂量多次给药组大鼠血清铁和转铁蛋白饱和度显著高于CRF对照组和Sham组（P＜0.01）;铁剂总剂量单次给药组大鼠血清铁水平及转铁蛋白饱和度显著高于CRF对照组（P＜0.05）,与Sham组无统计学差异（P＞0.05）;小剂量多次给药组大鼠血清总铁结合力显著高于CRF对照组,总剂量单次给药组、CRF对照组和Sham组之间无显著性差异（P＞0.05）;CRF对照组大鼠的血清铁蛋白、转铁蛋白水平显著低于Sham组、铁剂小剂量多次给药组和总剂量单次给药组（P＜0.05）,小剂量多次给药组、总剂量单次给药组以及Sham组之间无统计学差异（P＞0.05）。4.CRF对照组、右旋糖酐铁总剂量给药组和小剂量多次给药组3组大鼠的血清SOD、CAT及TAOC水平均较Sham组大鼠明显升高（P＜0.05）;总剂量给药组和小剂量多次给药组两组大鼠血清SOD、TAOC水平与CRF对照组大鼠相比无显著性差异（P＞0.05）,血清CAT水平较CRF对照组升高（P＜0.05）;总剂量给药组和小剂量多次给药组之间血清SOD、CAT及TAOC水平无统计学差异（P＞0.05）;CRF对照组、总剂量给药组和小剂量多次给药组大鼠的血浆GSH-Px较Sham组大鼠有显著性降低（P＜0.05）。5.CRF对照组血浆AOPP显著高于Sham组,静脉铁剂组显著高于CRF对照组（P＜0.05）,小剂量多次给药组显著高于总剂量给药组（P=0.002）。6.CRF对照组、右旋糖酐铁总剂量给药组和小剂量多次给药组3组大鼠血浆MDA均显著高于Sham组（P＜0.01）,静脉铁剂小剂量多次给药组显著高于总剂量给药组及CRF对照组（P＜0.01）,总剂量给药组与CRF对照组之间无显著性差异（P＞0.05）。7.CRF对照组、右旋糖酐铁总剂量给药组和小剂量多次给药组3组大鼠肾脏病理改变相似,肾小球硬化指数和小管间质纤维化评分的比较无统计学差异（P＞0.05）。8.静脉铁剂对于心、肝、肾等组织氧化应激指标的影响在不同的组织中存在差异性:各组左室心肌组织总SOD、GSH-Px活性以及MDA水平无统计学差异（P＞0.05）;CRF对照组、右旋糖酐铁小剂量多次给药组和总剂量组3组大鼠肾脏皮质、肝脏组织总SOD活性均低于Sham组（P＜0.01）,但其之间无统计学差异（P＞0.05）;右旋糖酐铁小剂量多次给药组肾脏MDA水平显著高于其余各组（P＜0.01）,总剂量给药组、Sham组和CRF对照组间无显著性差异（P＞0.05）;右旋糖酐铁小剂量多次给药组和总剂量给药组大鼠肝组织MDA水平显著高于Sham组和CRF对照组（p＜0.05）,两组静脉铁剂之间以及Sham组与CRF对照组之间无统计学差异（P＞0.05）。结论1.右旋糖酐铁100mg/kg单次静脉注射和右旋糖酐铁10mg/kg多次注射给药均能显著改善5/6肾大部切除大鼠的贫血和铁代谢指标。2.5/6肾大部切除大鼠给予静脉铁剂后,血中一些重要的抗氧化酶SOD及GSH-Px和CRF对照组相比并无明显差异,而血浆MDA和AOPP升高明显,提示静脉铁剂对于机体脂质氧化和蛋白氧化的影响可能大于对抗氧化酶的影响;3.右旋糖酐铁100mg/kg单次静脉注射在对血浆MDA和血浆AOPP不利影响方面要低于10mg/kg小剂量10次注射,提示总剂量疗法在较长时间内可能对脂质及蛋白质过氧化的不利影响要弱于小剂量重复给药;4.静脉补铁后不同组织中,氧化应激的改变并不一致,提示静脉铁剂对不同组织的氧化应激作用存在一定的差异;5.尽管存在着氧化应激改变,但实验中铁剂治疗组的肾损伤相关指标无显著差异。第三部分:维生素E和α-硫辛酸对高剂量静脉铁剂诱导慢性肾衰竭大鼠氧化应激反应的防治研究研究背景和目的CKD机体的氧化应激状态与其远期并发症,如动脉粥样硬化、透析相关性淀粉样变、贫血等的发生密切相关。抗氧化治疗已成为CKD治疗的重要部分。目前已经证实,常规剂量静脉铁剂可以引起氧化应激指标如MDA等一过性升高,也可引起一过性的尿酶和尿蛋白排泄增加,通常在24h内恢复。但在第一和第二部分研究中,我们发现反复多次常规剂量或一次高剂量的静脉铁剂可以引起CRF大鼠较长时间内血氧化应激标志MDA及AOPP的持续升高,这表明在进行高剂量或小剂量反复静脉补铁时,有必要进行抗氧化的防治。高剂量静脉铁剂给药方法由于给药方便,在临床上有很好的应用前景,高剂量静脉铁剂相关的氧化应激、炎症以及组织损伤的研究并不多见,新发现的一些急性肾损伤的早期标识如KIM-1、NGAL以及IL-18对于认识铁剂相关急性肾损伤是否有一定帮助作用?补充抗氧化剂是减轻CKD机体氧化应激的常用策略,维生素E和α-硫辛酸是目前常用的抗氧化剂。本部分实验我们选择Vit E和α-硫辛酸作为抗氧化药物,通过5/6肾大部切除CRF大鼠模型,在给予一次性高剂量的静脉铁剂同时使用VitE或α-硫辛酸,观察静脉补铁24h和72h后大鼠体内氧化应激、炎症状态及肾组织中KIM-1、NGAL以及IL-18 mRNA等的改变,希望为高剂量静脉补铁时短期内CKD机体氧化应激、炎症状态的变化以及常用抗氧化剂能否改善机体氧化应激状态提供实验依据。方法选用6周龄200-230g的雄性SD大鼠,两步法5/6肾大部切除术建立慢性肾衰竭大鼠模型。右肾切除术后第4周,将符合条件的慢肾衰大鼠随机分为CRF对照组、低分子右旋糖酐铁组（Fe组）、低分子右旋糖酐铁+维生素E组（Fe+VitE组）、低分子右旋糖酐铁+α-硫辛酸组（Fe+α-LA组）,每组每个时间点6只大鼠。Vit E和α-硫辛酸在静脉补铁前5天开始按100mg/kg灌胃持续至处死大鼠,静脉铁剂为低分子右旋糖酐铁（科莫非）50mg/kg一次性尾静脉注射,CRF对照组大鼠给予同等体积的生理盐水灌胃和尾静脉注射。在铁剂静脉给药后24h、72h分别处死各组大鼠,比较各组大鼠血和组织氧化应激、炎症指标以及肾脏皮质中KIM-1、IL-18、NGAL mRNA的表达情况。结果1.4组CRF大鼠在静脉补铁后24h和72h时各组Scr、BUN、Hb、血压相比无统计学差异（P＞0.05）。2.静脉补铁24h后,Fe组、Fe+Vit E组、Fe+α-LA组各组大鼠血清SOD、血浆GSH-Px较CRF对照组显著降低（P＜0.05）,72h时仍显著低于CRF对照组（P＜0.05）,各时点静脉补铁三组之间无显著性差异（P＞0.05）。静脉补铁24h后,Fe组大鼠血清CAT、TAOC和Fe+Vit E组血清TAOC与CRF对照组没有统计学差异（P＞0.05）,Fe+Vit E组、Fe+α-LA组大鼠血清CAT水平较CRF对照组和Fe组显著升高（P＜0.05）,Fe+α-LA组血清TAOC水平较CRF对照组和Fe组显著升高（P＜0.05）;72h时,单纯Fe组血清CAT、TAOC显著高于CRF对照组（P＜0.05）,Fe+Vit E组和Fe+α-LA组大鼠血清CAT显著高于CRF对照组和单纯Fe组（P＜0.05）,Fe+Vit E组血清TAOC水平与CRF对照组相当（P＞0.05）,低于Fe+α-LA组（P＜0.05）。3.Fe组、Fe+Vit E组、Fe+α-LA组和CRF对照组之间静脉补铁后72h时大鼠血浆AOPP值无统计学差异（CRF对照组Vs Fe组Vs Fe+α-LA组Vs Fe+Vit E组:51.31±9.56 Vs 66.83±18.61 Vs 67.81±11.38 Vs 63.97±19.19μmol/L,P＞0.05）。4.静脉补铁24h后,Fe组、Fe+Vit E组、Fe+α-LA组3组大鼠血清TNF-α、MCP-1水平较CRF对照组显著升高（P＜0.05）,3组间无统计学差异;静脉补铁后72h时Fe组、Fe+Vit E组、Fe+α-LA组3组大鼠血清TNF-α水平较24h组明显下降（P＜0.05）,但仍显著高于CRF对照组大鼠（P＜0.05）。Fe组大鼠血清MCP-1水平较CRF对照组显著升高（P＜0.05）,Fe+Vit E组MCP-1水平下降与CRF对照组已无显著性差异（P＞0.05）,Fe+α-LA组大鼠血清MCP-1水平显著高于其余各组（P＜0.01）。5.静脉补铁24h及72h后,CRF对照组、Fe+Vit E组、Fe+α-LA组3组之间大鼠肾脏皮质组织匀浆MDA、SOD和GSH-Px水平、肝脏GSH-Px活力相比均无统计学差异（P＞0.05）;静脉补铁24h后,Fe+Vit E组肝脏MDA较CRF对照组显著升高（P＜0.05）,Fe+α-LA组大鼠肝脏MDA显著低于单纯Fe组和Fe+Vit E组（P＜0.05）,Fe组和Fe+Vit E组之间无统计学差异（P＞0.05）;静脉补铁72h后,Fe和Fe+Vit E组大鼠肝脏MDA水平均高于CRF对照组（P＜0.05）,Fe+α-LA组大鼠显著低于单纯Fe组和Fe+Vit E组（P＜0.05）。静脉补铁24h后,Fe组心肌MDA较CRF对照组显著升高（P=0.033）,Fe+VitE组、Fe+α-LA组大鼠心肌MDA显著低于单纯Fe组（P＜0.05）,静脉补铁72h后,4组大鼠之间已无统计学差异（P＞0.05）。静脉补铁24h后,单纯Fe组和Fe+Vit E组心肌SOD、GSH-Px比CRF对照组及Fe+α-LA组显著降低（P＜0.05）,静脉补铁72h后,单纯Fe组和Fe+Vit E组大鼠心肌SOD水平仍低于CRF对照组（P＜0.05）,单纯Fe组与CRF对照组GSH-Px相比无统计学差异（P＞0.05）。Fe+α-LA组大鼠心肌GSH-Px显著高于CRF对照组及单纯Fe组（P＜0.05）。6.静脉补铁24h后,Fe组大鼠肾皮质KIM-1的表达较CRF对照组显著下降（P=0.001）,Fe+α-LA组、Fe+Vit E组和CRF对照组相比无显著性差异（P＞0.05）,但均显著高于单纯Fe组（P=0.001）。单纯Fe组大鼠肾皮质NGALmRNA表达较CRF对照组显著升高（P＜0.05）,Fe+α-LA组和CRF对照组没有显著性差异（P＞0.05）,但均显著低于单纯Fe组（P＜0.05）。单纯Fe组大鼠肾皮质Il-18 mRNA表达较CRF对照组显著升高（P＜0.05）,Fe+α-LA组和Fe+Vit E组Il-18 mRNA表达显著低于单纯Fe组和CRF对照组（P＜0.05）;静脉补铁后72h,各组间大鼠肾皮质KIM-1、NGAL、IL-18 mRNA的表达无显著性差异（P＞0.05）。结论1.静脉使用高剂量（50mg/kg）的低分子右旋糖酐铁短时间内可引起5/6肾大部切除CRF大鼠血中SOD、GSH-Px下降等氧化应激以及MCP-1及TNF-α升高的炎症反应;2.口服Vit E和α-LA对高剂量低分子右旋糖酐铁相关的氧化应激反应具有一定的防治作用,对于MCP-1及TNF-α升高等炎症反应防治作用不明显;3.高剂量（50mg/kg）低分子右旋糖酐铁静脉注射24h和72h内,急性肾损伤早期标识IL-18及NGAL mRNA在肾皮质的表达存在一过性升高,Vit E和α-LA能抑制二者的高表达;4.Vit E和α-LA可能通过抑制氧化应激反应而对高剂量静脉铁剂的肾脏毒性有一定的保护作用。
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