降糖三黄片对糖尿病大鼠肾脏保护作用及机理研究

论文摘要

第一部分文献研究糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一,是导致终末期肾功能衰竭的重要原因,其特征性病理变化是早期肾小球高灌注、肾小球肥大、系膜区扩张、基底膜增厚及细胞外基质堆积,以致肾小球硬化、肾间质纤维化。DN发病机制非常复杂,其确切的发病机制尚未完全阐明,现代医学认为多个信号转导系统在糖尿病肾病发病过程中具有重要的作用,治疗主要通过控制血糖、控制血压、纠正脂质代谢紊乱以及血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂类药物的应用,干预这些系统中的相关环节在不同程度上推迟、控制DN的发展。因此,更好地了解和采取积极的预防措施,减缓疾病的进程是治疗的关键。糖尿病肾病乃现代医学的病名,在古代医籍中并没有相对应的病名记载。然而,综观糖尿病肾病的发病机理和临床表现应属于祖国医学中的消渴病及其并发症包括“水肿”、“虚劳”、“肾劳”、“水病”、“胀满”、“尿浊”、“关格”等范畴。中医学认为DN发生是多种因素引起,本虚标实为其基本病机。本虚指阴阳、气血、五脏之虚,标实指痰浊、水湿、瘀血等病理之实。肺、胃脾、肾三脏之阴亏虚,而导致肺燥、胃热、肾虚,其中肾阴不足是决定因素。临床表现多为虚实夹杂。治疗上以中医辨证论治思想为基础,根据病程发展的不同阶段,正邪双方的强弱、进退；机体气血阴阳及脏腑的功能状态,进行整体调节,早期以益气养阴逐瘀,佐以滋补肝肾；中期以温肾健脾为重,辅以益气养血祛瘀；晚期以温补脾肾、佐以利水消肿化瘀。达到减少蛋白尿、改善肾功能、延缓疾病的发展有一定的作用。中医药在治疗DN方面有着独特的优势,中药及其配伍的药理效应具有多层次、多靶点、多环节的功能特点,而且远期疗效亦较稳定,具有比西药更大的优势。在临床上,对于症状的改善,肾功能的保护以及延缓和阻止肾脏损害的病程进展,提高DN患者生存质量都有良好的作用。本学科在80年代已经开展对Ⅱ型糖尿病的中医防治研究,围绕气阴不足、瘀血阻络的病机,采用经方桃核承气汤为基础加味研制成降糖三黄片,在临床上治疗Ⅱ型糖尿病取得显著疗效。运用降糖三黄片治疗糖尿病肾病其理论依据是胃、肾之间无论在生理或病理上都相互作用、相互影响。因此,进一步深入探讨降糖三黄片对于糖尿病肾病的疗效及作用机制对于其在临床的广泛应用具有深远的意义。第二部分实验研究目的：以长期高脂饲养（与目前人类饮食生活方式更为接近）的方式,观察中药降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠的血糖、血脂、肾功能、24小时尿蛋白定量、肾组织组织形态学及肾组织ACE活性、血管紧张素Ⅱ、转化生长因子-β1以及蛋白激酶C的影响,初步探讨其对糖尿病肾病的治疗及其作用机理,为临床应用泻热逐瘀,益气养阴方药治疗早期糖尿病肾病提供实验依据。方法：清洁级Wistar大鼠普通饲料适应性喂养2W后,随机分为2组,正常组（10只）和造模组,正常组继续以普通饲料喂养,造模组改用高脂高热量饲料喂养一个月。造模前禁食12h,造模组按30mg/kg剂量腹腔内注射STZ,正常组腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。1W后,测定空腹血糖和空腹胰岛素,计算胰岛素敏感指数。连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,查尿糖++以上,胰岛素敏感指数降低,且有多饮、多尿、多食现象确认为2型糖尿病模型。2型糖尿病大鼠成模后,继续以高脂饲料连续喂养8W,即出现糖尿病大鼠的肾脏损害（以电镜结果为证）。糖尿病造模成功后,造模组进一步分层,随机分为模型组、中药组（降糖三黄片干预）,西药组（卡托普利干预）。共44只大鼠完成实验,正常组10只,模型组10只,降糖三黄片干预组12只,卡托普利干预组12只（余5只或死亡或不符合条件）。中药组药量按787.5mg/kg/d的剂量给予,西药组药量按照4mg/kg/d的剂量给予,正常组及模型组灌服等量蒸馏水。①STZ注射后1周后大鼠禁食12h后空腹眼眶静脉窦采血,糖尿病大鼠造模成功后8周,处死前腹主动脉采血检测FBG、胆固醇和甘油三酯以及胰岛素。②于造模后四周、八周分别检测大鼠24h尿量、尿蛋白。③无菌操作取双肾,剥离被膜称重,计算肾重/体重指数（KW/BW）;取右肾组织4%多聚甲醛初步固定,用于观察肾脏病理形态学变化；血、尿生化指标均用全自动生化分析仪测定。④放免法检测各组肾肌组织中AngⅡ含量及紫外分光亮度法检测ACE活性；⑤免疫组化检测肾皮质TGF-β1蛋白水平和PKC活性；同时以光学显微镜和透视电子显微镜观查肾小球、肾小管-间质的病理形态学改变。结果：1.实验第8周末,观察大鼠各项指标。结果表明,降糖三黄片明显改善DN大鼠的一般状态,三多一少的症状,体重明显增加,与模型组和西药组大鼠相比,差异显著（P<0.01）；降糖三黄片组血糖、血脂水平明显下降,胰岛素敏感指数上升,与模型组和西药组比较有显著性差异（P<0.01；P<0.05）；提示中药组对糖代谢有改善作用,并且作用优于西药组；显著改善实验大鼠多尿、多饮的症状,降低24h尿蛋白排泄量,与模型组比较差异显著（P<0.01）。2.利用放射免疫法和紫外分光亮度法检测各组实验动物肾脏标本中的肾组织血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量和血管紧张素转换酶（ACE）活性。结果表明：模型组肾组织ACE活性明显增强,与正常组、中药组、西药组比较有显著的差异（P<0.01）；说明降糖三黄片具有一定的抑制DN大鼠肾组织中ACE活性,但其作用强度则低于血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）的卡托普利。模型组大鼠肾组织AngⅡ的含量比正常组、西药组和中药组显著升高（P<0.01）；两治疗组之间比较无统计学意义（P>0.05）。实验结果说明,降糖三黄片和西药卡托普利均有一定降低DN大鼠肾组织中AngⅡ含量的作用,表明中西药都能通过调节AngⅡ的分泌,起到保护肾功能的作用。3.本实验通过光镜、电镜观察各组8周末肾组织形态学变化。结果表明：模型组肾脏局灶肾小管内见蛋白沉积,肾小球增大,毛细血管基质增生,肾小球基底膜增厚,部分肾小管上皮细胞水肿变性。透射电镜观察结果显示肾小球基底膜呈阶段性增厚,有的模糊不清,上皮足突广泛融合或部分融合,滤过膜间隙增大,系膜区扩大,系膜细胞增多。降糖三黄片组经治疗8周后上述病理改变比模型组显著减轻；提示造模组大鼠肾脏组织损害可能从模型建立初期已经发生,并且呈进行性加重。模型组及西药组的肾小球硬化指数、肾小球毛细血管基质增生程度均高于正常组和中药组,其中肾小球毛细血管基质增生程度与正常组和中药组比较差异明显（P<0.05）；肾小球平均横截面积（MGA）较正常组和中药组显著增大（P<0.01）,提示模型组及西药组的肾小球硬化明显。降糖三黄片对于延缓DN的肾脏病理损害疗效确切。4.采用免疫组化方法观察降糖三黄片对DN大鼠肾组织中TGF-β1的表达和PKC活性。免疫组化结果显示,TGF-β1阳性表达部位主要在肾小管胞浆,模型组TGF-β1明显高于正常组和中、西药组（P<0.01）,西药组略低于中药组但无显著性差异。模型组肾小管PKC活性明显高于正常组,差异具有统计学意义（P<0.01）。中药组和西药组差异不大,但仍高于正常组（P<0.01）,与模型组相比则明显降低,有统计学意义（P<0.01）。结论：1.中药降糖三黄片不仅能从客观指标上降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平,改善胰岛素抵抗,还能够明显改善糖尿病大鼠“三多一少”的症状,体现了中医学整体观念的思想。2.中药降糖三黄片能够降低DN大鼠尿蛋白排泄,抑制早期肾脏肥大,减轻肾脏病理损害和延缓肾脏病理进展,其作用机制与纠正脂代谢紊乱及血液流变学异常有关。3.降糖三黄片对DN大鼠肾组织AngⅡ有一定的抑制作用,这可能是其具有改善肾功能、减轻肾脏病理损害和延缓肾脏病理进展的作用机制之一4.降糖三黄片能抑制DN大鼠PKC和TGF-β1的过度表达,减少细胞外基质积聚,是减轻肾脏病理损害的重要环节。5.降糖三黄片对DN大鼠肾组织的保护作用可能是通过抑制肾组织AngⅡ活性、调控大鼠肾组织PKC活性的升高及转位,下调TGF-β1的过度表达,进而减少肾小球细胞外基质的积聚,使肾脏病理得到改善甚至逆转,从而达到保护肾脏的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献及理论研究
• 第一节 现代医学对糖尿病肾病的认识和研究
• 一、糖尿病肾病的发病机制
• 二、糖尿病肾病的信号转导机制
• 三、糖尿病肾病的早期诊断
• 四、糖尿病肾病的防治现状
• 五、展望
• 第二节 中医学对糖尿病肾病的认识和研究
• 一、糖尿病肾病的起源
• 二、病因病机
• 三、辨证论治
• 四、单味中药及中药制剂的临床研究
• 五、其他疗法
• 第三节 加味桃核承气汤治疗糖尿病肾病的理论基础
• 一、理论依据
• 二、从少阴病下法论降糖三黄片治疗糖尿病肾病
• 第四节 加味桃核承气汤的研究基础
• 一、调节血糖、血脂和改善胰岛素抵抗的作用机理研究
• 二、对DM慢性并发症的作用机理研究
• 三、小结
• 参考文献
• 第二章 实验研究
• 实验一 降糖三黄片对糖尿病大鼠肾脏的保护作用
• 一、实验材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 六、参考文献
• 实验二 降糖三黄片对糖尿病大鼠肾脏组织形态学变化的影响
• 一、实验材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 六、参考文献
• 实验三 降糖三黄片对DM大鼠肾组织肾素—血管紧张素系统的影响
• 一、实验材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 六、参考文献
• 实验四 降糖三黄片对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1表达的影响
• 一、实验材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 六、参考文献
• 实验五 降糖三黄片对糖尿病大鼠肾脏PKC信号传导通路的影响
• 一、实验材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、小结
• 六、参考文献
• 结语
• 结论
• 创新点
• 不足
• 展望
• 附图
• 附图一 实验末各组大鼠肾组织HE染色病理切片观察（X100）
• 附图二 DM大鼠肾脏超微结构（TEM）
• 附图三 实验末各组大鼠肾组织TGF-β1的表达（免疫组化x400）
• 附图四 实验末各组大鼠肾组织PKC活性的表达（免疫组化x400）
• 附图五 实验动物WISTAR大鼠
• 附录
• 附录一 中英文缩略词表
• 附录二 高脂饲料配比
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 致谢