论文摘要
末端酶（terminase）又称为包装酶,是dsDNA病毒和噬菌体包装过程的必要功能蛋白。这类病毒在生物合成的晚期,于宿主胞浆内形成大量空的前衣壳（procapsid）,尾蛋白和以滚环复制方式产生的多基因组串联拷贝体（concatemer,concatemericDNA）,这些由单拷贝基因组首尾相连组成的长链DNA就为末端酶的作用底物。末端酶从中剪切出单个基因组,并将该基因组填塞入已组装好的前头中,完成病毒的包装。噬菌体末端酶通常具有两个亚单位,因分子量不同而分为大亚单位（large subunit）和小亚单位（small subunit）。末端酶所参与的病毒包装过程具有突出特点,可作为蛋白质与蛋白质,蛋白质与核酸等大分子之间复杂相互作用的研究载体;同时,由于末端酶作为病毒生物周期中的特有功能蛋白质,其宿主（如细菌和真核生物）根本不存在这一生理过程和相关的功能酶,将末端酶作为控制噬菌体和病毒感染的药物靶点,具有高度的特异性和安全性。因此,末端酶的克隆表达、功能鉴定及深入的应用研究是一个极富意义的研究领域。噬菌体PaP3为本室分离鉴定的一株铜绿假单胞菌噬菌体,在完成其基因组全序列测定（GenBank登录号:NC004466）后发现,所有71个推定基因中,同源序列比对只发现了6个推定基因在公共数据库中存在同源性序列,其中orf3编码产物被推定为噬菌体末端酶大亚单位。在基因组测序完成之后,基因功能的研究成为我们面前的重要任务。为了完善噬菌体PaP3基因组注释并进一步深入认识该噬菌体的包装机制,本研究通过克隆表达该基因,获得了具有末端酶大亚单位活性的重组蛋白质,证实了该基因的功能;并在此基础上,推定PaP3的orf1编码蛋白为末端酶小亚基,然后通过实验室证据初步证实了推论的正确性,完成了对噬菌体PaP3末端酶全酶的功能鉴定。主要的研究内容和结果如下:1.噬菌体PaP3推定末端酶大亚单位的包涵体表达、纯化与复性:①利用PCR从噬菌体PaP3基因组上扩增出推定末端酶大亚单位（terminase large subunit）编码基因出。②将推定tls全长基因插入表达载体pQE31,转化大肠杆菌JM109,获得的pQE31-tls/ JM109工程菌表达产物经超声裂解后,90%以上的融合蛋白质H6-TLS以包涵体的形式存在。③将pQE31-tls/ JM109工程菌装料入在3.75L发酵罐中,调节pH值在7.0～7.4,控制溶氧指数在30%～4O%。OD600≈2.5时启动恒速补料,补料流速为1.25ml/min,共补料20×LB 150ml。湿菌重显著提高达36.241g/L,目标蛋白表达率达到20.36%。④将pQE31-tls/ JM109工程菌发酵培养物制备得到融合蛋白包涵体,将包涵体裂解液经Ni-NTA亲和纯化后,进一步采用阴离子交换层析纯化,获得纯度达90%的目标蛋白。⑤将纯化好的重组H6-TLS蛋白质经透析法复性,并采用BCA法蛋白质定量后,冻存备用。2.噬菌体PaP3推定末端酶大亚单位的实验验证:①在基因组末端cosN两侧分别设计一对引物,通过PCR扩增出含有末端酶大亚单位剪切位点的1050bp片段,并将之连接至T载体构建出底物质粒pMD-cos。②在含有Mg2+和K+的缓冲液中,200μg重组H6-TLS与20ng的pMD-cos底物质粒在37℃作用3小时,电泳结果显示重组H6-TLS蛋白可将底物质粒部分线性化。③合成并用生物素标记基因组末端cosN位点20bp的寡核苷酸,定量后冻存备用。将重组蛋白H6-TLS与cosN进行EMSA实验后发现,在含有10mmol/L CaCl2的缓冲液中,H6-TLS蛋白可以与cosN结合,与未加入H6-TLS蛋白的对照相比,结合H6-TLS蛋白后的cosN片段明显滞后,说明了重组H6-TLS具有特异性结合DNA片段的能力。④利用超微量ATP酶检测试剂盒未能检测到重组H6-TLS蛋白质的ATP酶活性。3.噬菌体PaP3末端酶大亚单位的分泌型表达及部分酶学活性的初步研究:①利用PCR从噬菌体PaP3基因组上扩增出末端酶大亚单位tls全长基因。②将tls全长基因插入分泌型表达载体pET22（b）+,转化大肠杆菌BL21（DE30）,成功构建pET22（b）-tls/BL21（DE30）工程菌。在1.2ug/ml氯霉素和100ug/ml AMP抗生素下,以0.05mol/L终浓度的IPTG,25℃过夜诱导,目的蛋白可实现分泌型表达,全部存在于超声裂解的上清中。经Ni-NTA亲和纯化后,可从菌液上清中分离到重组TLS-6H融合蛋白质,纯度达80%以上。③利用化学发光法,可检测到TLS-6H的ATP酶活性,且为DNA非依赖性。④经检测发现分泌型表达的TLS-6H蛋白质较高的核酸内切酶活性,且该酶最佳反应条件为pH8.0,50 mmol/L Mg2+,50mmol/L K+,37℃,1h;其活性不被ATP和精脒增强。4.噬菌体PaP3末端酶小亚单位基因PaP3p01的推定与功能研究:①通过基因排列顺序,蛋白质保守性结构域和二级结构的分析,初步确定PaP3p01为推定小亚单位编码基因tss（terminase small subunit）。②利用PCR从噬菌体PaP3基因组上扩增出PaP3p01全长基因。③将推定tss基因连接至pQE31表达载体上,转化大肠杆菌JM109,获得表达稳定的pQE31-tss/JM109工程菌。该工程菌目的蛋白表达量达总菌体含量25.8%,且以可溶性状态存在于宿主菌JM109的胞浆中。③经Ni-NTA亲和层析纯化及分子筛脱盐后,获得纯度达90%的目的蛋白。④经分析确定基因组末端左右各100bp共239bp为小亚单位结合靶DNA片段,并进行3’端生物素标记。⑤通过EMSA实验,检测出H6-TSS与239bp靶DNA片段结合,使该DNA片段后滞,但并不结合239bp下游非特异DNA条带。综上所述,本研究在数据库检索和理论推导的基础上,确定了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的末端酶大亚基与小亚基,并以实验室证据证实了生物信息学推论的正确性,同时还对末端酶的部分酶学活性进行了初步研究。为完善噬菌体PaP3基因组功能注释,以及病毒包装机制的深入研究奠定了基础。
论文目录
相关论文文献
- [1].噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的作用研究[J]. 免疫学杂志 2008(02)
- [2].铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性[J]. 第四军医大学学报 2008(02)
- [3].辣椒花器官发育相关PAP3基因的克隆与生物信息学分析[J]. 江苏农业科学 2016(07)
- [4].铜绿假单胞菌噬菌体PaP3全基因组在感染宿主菌PA3过程中的分时期表达研究[J]. 免疫学杂志 2012(05)
- [5].推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测[J]. 第三军医大学学报 2009(05)
- [6].铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的溶原化条件及稳定性研究[J]. 医学研究生学报 2009(11)
- [7].通过RNA-seq初步考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的全局性调控[J]. 免疫学杂志 2013(04)
- [8].辣椒花器官发育PAP3基因和PDS基因VIGS载体的构建及鉴定[J]. 中国瓜菜 2014(01)
- [9].辣椒PAP3和PPI蛋白相互作用的鉴定[J]. 园艺学报 2016(03)
标签：末端酶论文; 末端酶大亚单位论文; 末端酶小亚单位论文; 噬菌体论文; 核酸内切酶论文; 位点论文; 结合能力论文; 铜绿假单胞菌论文;