论文摘要
目的:食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤。我省西南部磁县、涉县地区是食管癌的集中高发区。其发病率、死亡率在国内一直处于较高的水平。目前主要的治疗手段是手术、化疗及放疗,但晚期肿瘤5年生存率仅在20%左右,其疗效仍然不能令人满意。因此探索新的提高癌细胞杀伤途径成为研究热点之一。锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, MnSOD）存在于细胞线粒体内,由SOD2基因编码的含锰超氧化物歧化酶,位于人染色体6q25.3。MnSOD能将超氧自由基O2-转化成H2O2, H2O2在过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）和过氧化氢酶（catalase, CAT）的作用下分解为水和氧,使细胞无毒化,是人体细胞内一种重要抗氧化酶。在乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌中存在着缺失或表达水平降低;而MnSOD过量表达可降低转移率,并且能抑制或逆转人的纤维母细胞SV40、恶性黑色素瘤及神经胶质瘤的恶性表型及生长,而被认为是一种新的抗癌基因,但其与食管癌关系的研究尚未见报道。MnSOD启动子区上游9位点T→C转换导致缬氨酸（Val）→丙氨酸（Ala）的氨基酸替换,可能通过降低本身活性使其对ROS的清除能力降低,从而诱发肿瘤的发生。研究显示MnSOD低表达可能与MnSOD基因单核苷酸多态性有关。MnSOD的活性降低,造成细胞抗氧化损伤能力下降,肿瘤的发生风险增加。国外学者研究发现该位点多态性增加了肺癌、前列腺癌、乳腺癌的发病风险,但关于MnSOD（-9 T>C）与华北地区高发的食管癌易感性之间的关系至今未见大样本相关报道。同时,我们前期研究发现,MnSOD过量表达并不总是抑制肿瘤的生长,在骨肉瘤SaOS2细胞中,过高表达株明显抑制细胞生长,表现为平皿接种效率低,倍增时间延长,而中等表达细胞则较母细胞株的平皿接种效率高,倍增时间缩短。这种现象是否仅对骨肉瘤SaOS2特定细胞?对食管癌细胞的作用又如何?因此,我们试图通过对食管癌细胞株转染不同过量表达MnSOD基因,探讨该基因过量表达在体内和体外对食管癌细胞增殖的影响,以期探索肿瘤治疗的新途径。方法:1全面收集1976-2009间发表的有关MnSOD基因多态性与食管癌、肺癌、前列腺癌发病关系的流行病学文献,利用STATA 11.0软件根据文献异质性检验结果,进行固定效应模型或随机效应模型的meta分析。对不同纳入标准的结果进行了敏感性分析,用漏斗图、线性回归法评估发表性偏倚。2采用免疫组织化学方法（SP法）和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chine reaction,RT-PCR）及Western blot分别检测45例食管鳞癌组织及距食管癌组织边缘5cm以上的镜下未见癌浸润的正常组织中MnSOD mRNA、蛋白的表达情况;并分析其与食管癌病理特征及生物学行为之间的关系。3采用慢病毒转染法将MnSOD重组质粒转染食管癌TE-1细胞,建立中、高过量表达MnSOD的稳定转染细胞（TE-1Mm细胞、TE-1Mh细胞）及空载体细胞（TE-1Mn细胞）。细胞免疫荧光、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测转染后TE-1细胞中MnSOD mRNA和蛋白的表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验、平皿克隆形成实验及流式细胞术（FCM）观察细胞增殖、凋亡、周期变化情况。同时,将MnSOD转染细胞接种到裸鼠皮下检测成瘤及肿瘤生长情况;免疫组织化学（SP法）、RT-PCR及Western blot检测移植瘤中MnSODMnSOD mRNA、蛋白的表达水平。MTT法评价一氧化氮供体硝普钠（sodium niitroprusside,SNP）、放射线及二者联合对细胞的抑制。流式细胞术（FCM）、RT-PCR及Western blot检测细胞凋亡、活性氧（reactive oxygen species, ROS）及一氧化氮供荧光强度及蛋白表达的变化。结果:1共纳入22个研究,合计20025例患者。对于食管癌,共纳入4个研究,共有620例患者,健康对照909例,Meta结果显示MnSOD基因多态性明显增加其发病风险（Val/Ala versus Val/Val: OR=1.58, 95% CI=1.22-2.04; Ala/Ala versus Val/Val: OR=2.25, 95% CI=1.61-3.15;Ala/Ala versus Val/Ala+ Val/Val: OR=1.69, 95% CI=1.07-2.67 ;Val/Ala+Ala/Ala versus Val/Val: OR=1.74, 95% CI=1.36-2.22）。对于前列腺癌,共纳入12个研究,共有4182患者,健康对照6885例,Meta结果显示MnSOD基因多态性明显增加了前列腺癌的发病风险（Val/Ala versus Val/Val: odds ratio （OR） =1.11, 95% confidence interval （CI） =1.01-1.22; Ala/Ala versus Val/Val: OR=1.25, 95% CI= 1.03- 1.51; Val/Ala+Ala/Ala versus Val/Val: OR=1.15, 95% CI=1.01- 1.31）。然而,对于肺癌,共纳入6个研究,共有3375患者,健康对照4050例,Meta结果显示MnSOD基因多态性明显降低了肺癌的发病风险（Ala/Ala versus Val/Val: OR=0.68, 95% CI= 0.59-0.78; Ala/Ala versus Val/Ala+ Val/Val: OR=0.71, 95% CI=0.54-0.93; Val/Ala+Ala/Ala versus Val/Val: OR=0.83, 95% CI=0.75-0.92）。2免疫组织化学方法、RT-PCR及Western blot显示:MnSOD蛋白和mRNA在食管鳞癌组织及正常食管组织中的表达阳性率分别为31.1%、86.7%,0.766±0.041、0.484±0.038,0.310±0.036、0.482±0.053,较正常食管组织明显低（P<0.05）;病变越长,浸润越深,分化越差,表达水平越低,显示MnSOD蛋白和mRNA表达水平与食管鳞癌组织中的病变长度、浸润深度及分化程度密切相关（P<0.05）,但与有无淋巴结转移、病变部位及大体病理类型无关（P>0.05）。3 RT-PCR显示,转染MnSOD的TE-1细胞中含有不同表达水平的目的基因;细胞免疫荧光、免疫化学及Western blot显示TE-1Mm细胞、TE-1Mh细胞含有不同表达水平的MnSOD蛋白。4 MTT法显示,稳定转染细胞接种培养48 h的细胞存活率,与对照细胞（TE-1细胞、TE-1Mn细胞）相比,TE-1Mm细胞的存活率下降,TE-1Mh细胞的存活率升高,组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。TE-1Mm细胞平皿克隆集落形成能力为23.0±2.7%,而TE-1Mh细胞为45.3±4.5%,分别低于、高于母细胞34.7±4.2%及空载细胞33.7±4.7%;组间相比差异具有统计学意义（P<0.05）。5 Annexin V-PI双染实验显示:TE-1Mm和TE-1Mh细胞的早期细胞凋亡率10.6±1.0%和1.0±0.1%,分别高于和低于TE-1（2.6±0.2%）和TE-1n（2.5±0.3%）（P<0.05）。FCM显示,TE-1Mm和TE-1Mh细胞线粒体凋亡荧光指数分别为0.948±0.019和1.076±0.022,与母细胞TE-1（1.000±0.022）、空载体细胞TE-1n（0.997±0.023）相比,差异具有统计意义（P<0.05）。6细胞周期:MnSOD过量表达使G0+G1期细胞数在TE-1Mm增多,在TE-1Mh减少;G2+M期和S期则在TE-1Mm减少,在TE-1Mh增多;与母细胞TE-1和空载体细胞TE-1n相比TE-1Mm细胞处在增殖期细胞少,而TE-1Mh细胞处在增殖期细胞多（P<0.05）。7 FCM测得TE-1Mm细胞内ROS荧光指数（0.859±0.040）,低于TE-1细胞（1.000±0.042）、空载体细胞（1.002±0.047）内ROS荧光指数,但高于TE-1Mh细胞内ROS的荧光指数（0.763±0.039）,组间相比差异具有统计学意义（P<0.05）。8裸鼠移植瘤实验表明,TE-1Mm细胞接种于裸鼠体内后,肿瘤生长慢,体积小,而TE-1Mh则相反,生长速度明显加快;其实体瘤中的MnSOD mRNA、蛋白表达水平与对照组比均有统计学差异（P<0.05）。9 0.5～2 mmol/L SNP及2、4、6Gy放射线处理48 h,TE-1Mm细胞生长抑制率明显增加,细胞生长明显减慢;TE-1Mh细胞抑制率反而降低,细胞生长加速。经多靶单击拟合细胞存活曲线,TE-1Mm细胞的D0、Dq及N值相对减小,SER值增加;而TE-1Mh细胞的模型参考值则与其相反。10 Annexin V-PI凋亡实验显示,SNP、2Gy照射、SNP+2Gy照射处理48 h后,TE-1Mm细胞凋亡率分别为13.8±0.7%、11.9±0.6%、29.6±1.1%,与TE-1Mh细胞相应凋亡率3.3±0.3%、3.0±0.3%、9.5±0.6%相比差异具有统计学意义（P<0.05）。11 FCM显示,SNP、2Gy照射、SNP+2Gy照射处理48 h后,TE-1Mm细胞NO荧光指数分别为13.8±0.7%、11.9±0.6%、29.6±1.1%,与TE-1Mh细胞相应荧光指数3.3±0.3%、3.0±0.3%、9.5±0.6%相比差异具有统计学意义（P<0.05）。12 Western blot结果显示,在相同时间（48 h）作用下,TE-1Mm细胞MnSOD蛋白表达在各处理组相对量分别为0.334±0.029、0.485±0.040、0.175±0.011 ;与TE-1Mh细胞相应蛋白表达量（0.415±0.038、0.604±0.059、0.234±0.024）相比差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 MnSOD基因多态性增加前列腺癌、食管癌的发病风险,但却能降低肺癌的发病风险。2食管鳞癌组织中MnSOD蛋白和mRNA的表达均降低,可能与食管癌的发生、发展及恶性度相关。检测MnSOD的表达能对食管癌的临床治疗和预后判断有一定价值。3两种MnSOD表达水平的食管癌细胞稳转株构建成功;MnSOD过量表达对食管癌TE-1细胞增殖具有抑制和促进的双向作用。4中等过量表达MnSOD增加食管癌细胞放射敏感性,抑制增殖,诱导凋亡,而高过量表达MnSOD则与之相反,为今后通过MnSOD提高放射敏感性来抑制肿瘤或通过其抗拒放射来保护正常细胞提供了可能性。
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