论文摘要
研究背景绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）发病率逐年增高,雌激素替代治疗（estrogen replacement therapy, ERT）虽能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率,但由于长期使用可能导致乳腺癌和子宫内膜癌的危险性增加等安全问题使其应用受到限制。大豆苷原（daidzein, DAI）是一种常见的植物雌激素（phytoestrogen, PE）,有雌激素样效应而无雌激素样副作用,近年来引起了人们广泛关注。最近的研究提示植物雌激素的骨保护作用具有剂量依赖性的双相作用特点,其机制尚不清楚,雌激素受体（estrogen receptors, ERs）和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors gamma, PPARy）可能参与介导调节机制,但相关研究报道较少,具体作用机制也不清楚。第一部分大豆苷原防治去卵巢大鼠骨质疏松症的量效作用及其对骨髓细胞ERs和PPARγ表达的影响目的研究不同剂量大豆苷原对去卵巢大鼠血清E2、ALP、脂联素（adiponectin）、瘦素（leptin）,骨密度（BMD）,以及对骨髓细胞ERα、ERβ和PPARγmRNA和蛋白表达水平的影响,探讨大豆苷原防治去卵巢大鼠骨质疏松症的量效作用,及其对骨髓细胞ERs和PPARγ表达的影响。方法将3月龄SD （Sprague Dawley）雌性大鼠（由复旦大学实验动物科学部提供）随机分为6组：假手术组（sham）、去卵巢组（行双侧卵巢切除ovariectomy, OVX）、去卵巢+戊酸雌二醇组（E2,戊酸雌二醇800μg/kg·d）、去卵巢+高剂量大豆苷原组（H-DAI,大豆苷原200 mg/kg·d）、去卵巢+中剂量大豆苷原组（M-DAI,大豆苷原50 mg/kg·d）和去卵巢+低剂量大豆苷原组（L-DAI,大豆苷原10 mg/kg·d）,除假手术组外,其余大鼠均切除卵巢,术后4周开始以相应的药物灌胃,3月后处死大鼠。取血清检测E2、ALP、脂联素及瘦素水平；取腰椎骨L1.5和左股骨检测骨密度后,脱钙行骨切片HE染色观察骨组织形态。从右股骨骨髓腔内提取出骨髓细胞,Realtime-RT-PCR方法检测骨髓细胞ERα、ERβ和PPARγmRNA表达,western blot法检测ERα、ERβ和PPARγ蛋白表达水平。结果1、E2组和L-DAI组血清E2、ALP、adiponectin及leptin浓度显著高于OVX组（P<0.05）；除了leptin浓度外,L-DAI组血清E2、ALP、adiponectin浓度显著高于E2组（P<0.05）、H-DAI和M-DAI组间血清E2、ALP、adiponectin及leptin浓度无显著差异（P>0.05）,均显著低于E2和L-DAI组（P<0.05）。2、sham组大鼠的左股骨及腰椎BMD均显著高于其他各组（P<0.05）。L-DAI组大鼠左股骨及腰椎BMD均比OVX组显著增高（P<0.05）,且E2组无显著性差异（P>0.05）。M-DAI组大鼠股骨BMD显著高于OVX组（P<0.05）,与E2及L-DAI组无显著性差异（P>0.05）；M-DAI组腰椎BMD与OVX组无显著性差异（P>0.05）。H-DAI组大鼠的左股骨及腰椎BMD显著低于L-DAI组（P<0.05）,与OVX组无明显差异（P>0.05）。3、大鼠左股骨及腰椎骨组织形态：与sham组比较,OVX组骨小梁数量显著降低,脂肪细胞显著增多。E2可增加骨小梁数量,减少脂肪细胞。大豆苷原三个剂量组中,L-DAI组可显著增加骨小梁数目及抑制脂肪生成；随着大豆苷原剂量的增加,骨小梁数量显著递减,脂肪细胞显著递增。4、L-DAI组大鼠骨髓细胞的ERαmRNA及蛋白表达量均显著高于M-DAI和H-DAI组（P<0.05）,较E2、OVX和sham组增高,但差异不显著（P>0.05）。各组ERβmRNA及蛋白表达量均低于ERa表达量,6组的ERβmRNA及蛋白表达水平未见明显组间差异。H-DAI组大鼠骨髓细胞的PPARγmRNA及蛋白表达水平显著高于M-DAI和L-DAI组（P<0.05）。结论1、大豆苷原对骨产生雌激素样作用,对去卵巢大鼠骨质疏松症有防治作用,且呈现剂量依赖性关系,低剂量时效果与雌二醇相当,高剂量时无骨保护作用。2、大鼠骨髓细胞均表达ERa和ERβ,但以ERa为主,提示ERa在骨保护作用中可能发挥主要作用。3、大豆苷原三个剂量组中,低剂量组大鼠骨髓细胞ERa表达显著高于中、高剂量组,提示低剂量大豆苷原对骨的保护作用可能是通过ERa来介导的。高剂量组大鼠骨髓细胞PPARγ表达显著高于中、低剂量组,提示高剂量大豆苷原可能通过作用于PPARγ,导致骨量减少及骨髓腔内脂肪细胞增多。4、本实验结果显示大豆苷原低剂量时可显著提高血清脂联素与瘦素水平,提示脂联素及瘦素可能参与了对骨质疏松症的防治作用。第二部分大豆苷原对人类成骨细胞骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的调节机制目的研究不同浓度大豆苷原（daidzein, DAI）对成骨细胞骨形成的量效作用,及雌激素受体（estrogen receptors, ERs）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ）对DAI骨形成的调节作用。方法①以培养的未经处理的人类胎儿成骨细胞（human fetal osteoblast, hFOB）为对照组（Ctrl组）,用17β-戊酸雌二醇（β-estradiol-17-valerate, E2）和不同浓度DAI分别处理hFOB 72小时后,MTT法测定细胞增殖情况,PNPP法测定成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性。②用ERs拮抗剂ICI182780、ERa拮抗剂MPP、PPARγ拮抗剂GW9662分别阻断受体ERs、ERα和PPARγ后,再给予E2及不同浓度的DAI处理,MTT法检测成骨细胞增殖情况并计算细胞增殖率,PNPP法测定ALP水平。③选用高低浓度的大豆苷原分别处理hFOB后,实时定量RT-PCR法检测ERα、ERβ和PPARγmRNA表达水平,western blot法检测ERαERβ和PPARγ蛋白表达水平。结果1、随着DAI剂量的增加,成骨细胞增殖率递减,DAI 10-9mol/L组较对照组显著升高,DAI 10-5mol/L组较对照组显著降低（P<0.05）。随着DAI剂量的增加,成骨细胞ALP水平递减；但差异无统计学意义（P>0.05）。2、ICI阻滞ERs后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别为88.16%、76.30%、81.18%、83.19%,均显著低于阻滞前（P<0.05）；MPP单纯阻滞ERa后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别为69.78%、63.31%、70.71%、78.43%,均显著低于阻滞前（P’<0.05）。MPP阻滞后,DAI 10-9mol/L组的ALP水平显著低于阻滞前（P<0.05）。3、GW阻滞PPARγ后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别是103.14%、96.99%、112.88%和122.22%,其中DAI 10-7、10-5 mol/L组均较阻滞前显著升高（P<0.05）,D9组轻度降低但差异无统计学意义（P>0.05）。DAI 10-5 mol/L组的ALP水平较阻滞前显著增加（P<0.05）。4、E2及DAI 10-9 mol/L组的ERαmRNA表达量无明显差异（P>0.05）,均显著高于DAI 10-5mol/L组（P<0.05）。DAI 10-5mol/L组PPARγmRNA表达量显著高于E2组（P<0.05）。5、与其余各组比较,DAI 10-9mol/L组ERα蛋白表达水平显著增加,DAI 10-5mol/L组PPARγ蛋白表达水平明显增加。6, ERβmRNA及蛋白表达量在Ctrl、DAI 10-9mol/L、DAI 10-5mol/L组中均低量表达,各组间均无明显差异。结论1、DAI的骨保护作用具有剂量依赖性的双相作用特点：低剂量DAI促进成骨细胞增殖和分化,高剂量DAI抑制成骨细胞增殖和分化。2、低剂量DAI可能主要通过作用于ERα促进成骨细胞增殖和分化,对PPARγ的作用不明显。3、高剂量DAI可能主要通过作用于PPARγ抑制成骨细胞增殖和分化,同时也可通过作用于ERs产生一定促进成骨细胞增殖的作用。4、E2对PPARγ无作用；低剂量大豆苷原可能通过ERβ对成骨细胞增殖产生负性作用。总结1、大豆苷原对骨质疏松症有防治作用,呈现剂量依赖性关系,低剂量时效果明显,高剂量无明显作用。2、低剂量大豆苷原可能主要作用于ERα,表现为骨生成增加,脂肪生成减少。3、高剂量大豆苷原可能主要作用于PPARγ,表现为脂肪生成增加,骨生成减少。4、ERα和PPARγ之间可能存在一种交叉对话的关系,介导大豆苷原防治骨质疏松症的量效作用。
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