神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究

论文摘要

干细胞（stem cell）能够不断进行自我更新,具有不同的分化潜能,在特定的条件下,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的细胞。根据分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞（totipotential stemcell）、多能干细胞（multipotential stem cell）和单能干细胞（unipotential stem cell）。根据细胞来源的不同又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。来源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）可以形成除了滋养层细胞以外的所有类型的细胞,进一步形成血液、神经等系统的干细胞,如造血干细胞（hematopoieticstem cells,HSC）和神经干细胞（neural stem cells,NSC）等,它们存在于多种胚胎和成体组织中,在组织修复和细胞数目的动态平衡中起重要作用。近年来,干细胞研究一直处于生命科学研究的前沿位置。干细胞具有的多项分化潜能和自我更新能力使其成为重要的种子细胞,在各种因素导致的组织和器官缺损性、退行性疾病以及先天缺陷性疾病的细胞替代治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,是一种组织特异性干细胞,能自我更新、增殖,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。目前人们已从胚胎、新出生动物和成年动物的小脑、大脑皮层、纹状体、室下区、海马及脊髓等部位成功地分离培养出了这种细胞。近年来,神经干细胞或者整合了特定基因的神经干细胞移植治疗神经损伤和神经退行性疾病的研究取得了令人瞩目的进展。来源于大脑皮层的神经干细胞具有较强的分化潜力和增殖能力,并且数量多、易分离提取,在体内外不同的微环境中可以被诱导分化为具有特定递质类型的神经元,从而可用于细胞替代治疗。肠神经系统（enteric nervous system,ENS）是存在于肠壁的相对独立的神经调节网络,调节消化管的吸收、分泌和运动功能。肠神经节中的神经细胞和神经胶质细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。神经节细胞和神经纤维在肠壁环形肌与纵形肌之间形成肌间神经丛,在粘膜下形成粘膜下神经丛。如果神经嵴细胞不能正常迁入原始消化管,或者迁入的神经嵴细胞不能分化为神经节细胞,就会引起诸多消化道神经运动障碍性疾病,如无神经节细胞性巨结肠病就是这样一种先天性疾病。无神经节细胞性巨结肠病（aganglionic megacolon）又称Hirschsprung氏病（Hirschsprung’s disease,HD,）,是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,发病率居消化道畸形第二位,据统计高达1/3000～1/5000。其主要病理变化是一段结/直肠肠壁内无神经节细胞,该段结/直肠持续性痉挛,肠腔狭窄,而其邻近的近端肠腔则扩张,内容物潴留。HD主要临床表现是腹胀,顽固性便秘,不完全性肠梗阻。手术切除病变狭窄肠段并进行端一端吻合是目前临床上唯一有效的治疗方法,但治疗效果并不令人十分满意。由于手术损伤和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症,严重者可致结肠破裂。如果病变累及直肠下段或大段结肠,手术切除后,还会引起大便失禁和代谢紊乱。干细胞理论和干细胞移植技术的进展,为该病的治疗提供了新思路,展现出一条崭新的途径。基于上述原因和理念,我们设计了该项研究,目的是为了探讨神经干细胞治疗无神经节细胞性巨结肠病的可行性,为此类疾病的治疗开辟一条新途径。本研究由三部分组成,即无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立、神经干细胞的分离培养和纯化扩增、神经干细胞的肠壁内移植和移植后检测。第一部分无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立进行神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究,首先必须建立一种适宜的该病动物模型。我们根据无神经节细胞性巨结肠病的病理变化特征及原理,以大鼠为实验动物,并根据阳离子表面活性剂苯扎氯胺（benzalkoniumchloride,BAC）能选择性地杀灭神经细胞而不损伤其他组织细胞的原理,经多次实验,找到了使用该药的最佳方式、最佳剂量和最佳作用时间,去除了直肠上段肠壁内肠神经丛的的神经节细胞,而肠壁的其他组织细胞未受损伤。术后4w,肉眼观察发现,BAC作用节段的肠管痉挛、狭窄,其上方肠管则扩张明显、内容物潴留。组织化学、免疫荧光染色等检查证实,BAC作用段肠壁内的肌间和粘膜下神经节细胞消失,神经纤维明显减少,乙酰胆碱酯酶的活性明显降低;直肠内测压显示直肠抑制反射（rectoanal inhibitory reflex,RAIR）消失。通过局部应用BAC的方法,我们成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,为进一步研究该病的治疗方法奠定了基础。第二部分神经干细胞的分离培养和纯化、扩增进行治疗性干细胞移植实验研究的另一个关键问题是选择理想的和足够数量的供体细胞。由于胚胎大脑皮层中的神经干细胞数量多、易提取、抗原性弱等优点,我们采用了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞,并对其提取、分离时间、培养纯化、扩增方法进行多次实验优化。从孕16天的Wistar大鼠胚胎中分离大脑皮层组织,经胰蛋白酶消化结合机械吹打获得单细胞悬液。用添加B27、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblast growth factor,bFGF）的无血清DMEM/F12培养基进行培养。培养72h后开始出现许多由十几个细胞聚集形成的集落样的小细胞团,呈悬浮状态。第6d-7d每个集落的细胞增至几十甚至上百个,形成神经球（neurosphere）。继续培养,每5-7天传代一次。然后通过巢蛋白Nestin的免疫细胞化学染色以检测神经干细胞及其纯度。用含10%胎牛血清的培养液培养进行诱导分化培养,培养7天后的细胞进行MAP2（microtubule associated protein 2）、GFAP（glial fibrillaryacidic protein）免疫细胞化学染色,以检测神经干细胞向神经元细胞和神经胶质细胞分化的特性。结果显示,原代培养和传代培养的细胞球内大多数细胞均呈Nestin强阳性着色。而在含血清培养基中培养7d后可见大量细胞从神经球中迁出,并呈神经元样及胶质细胞样形态,免疫细胞化学染色显示,MAP2阳性细胞占细胞总数的40.64%,GFAP阳性细胞占细胞总数的55.32%。以上结果显示培养的细胞具有神经干细胞的分化潜能。为了检测细胞的增殖情况,我们进行了5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）掺入实验。结果表明,神经球中有近90%的细胞呈BrdU阳性,这说明培养中的NSCs具有较强的增殖能力。第三部分神经干细胞肠壁内移植和移植后检测在成功建立无神经节细胞性巨结肠动物模型以及成功分离培养、纯化扩增了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞的基础上,我们进行了神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验。取已预先标记的第5代的神经干细胞,移植于用化学方法去除了神经节细胞的直肠上段。移植后用多种方法检测移植细胞的存活、分化和肠功能恢复情况。结果显示:移植8周后肠壁内有移植细胞存活,并可见部分细胞分化为PGP9.5阳性的神经细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞,主要分布于肌间和环形肌层。Western Blot结果表明,BAC去神经节细胞未移植组肠壁内神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide sythase,nNOS）及胆碱乙酰转移酶（Choline Acetyltransferase,ChAT）的表达较正常组明显降低,而干细胞移植组在移植后其肠壁内nNOS和ChAT的蛋白表达较未进行细胞移植的模型组明显增强。球囊扩张刺激测压结果显示,去神经节细胞未移植组直肠肛门抑制反射（rectoanal inhibitory reflex,RAIR）消失,而NSCs移植组RAIR恢复;直肠离体肌条的电场刺激（electrical field stimulation,EFS）实验结果也表明,正常对照组和NSCs移植组的直肠肌条在电场刺激（EFS）诱导下均出现较强的收缩反应,而未进行移植的HD模型组则未见明显反应。上述实验结果显示,大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞在肠壁内的微环境中可以存活并可分化为功能性神经细胞,从而使肠神经反射和运动功能得到一定程度的恢复。结论本项研究通过建立无神经节细胞性巨结肠病的大鼠实验模型,优化体外分离培养、增殖和纯化大脑皮层神经干细胞的条件,将神经干细胞进行无神经节细胞的肠壁内移植并进行了多项移植后检测,结果证明:取自胚胎大脑皮层的神经干细胞移植到无神经节细胞性巨结肠病动物模型的肠壁中可以存活,并能分化为具有神经节细胞特性的功能性神经细胞,对无神经节细胞性巨结肠有明显的治疗作用。尽管如此,神经干细胞移植的远期治疗效果还有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 神经干细胞的分离培养和纯化增殖
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第三部分 神经干细胞肠壁内移植和移植后检测
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间已发表和待发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
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