水稻OsAPX2基因转化紫花苜蓿及其耐盐性分析

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa）是目前世界上栽培最早、分布最广的优质豆科类牧草,其营养成分完全、干草产量高,素有“牧草之王”的美誉,在畜牧业中占有非常重要的地位。近些年来,全球的粮食安全问题越来越严重,尤其是在我国。更多肥沃的土地用来生产粮食,而像苜蓿这样的牧草则需要寻找新的种植地。如果能够在土壤盐碱化、荒漠化、干旱缺水的地区种植苜蓿,则可以很好的解决粮食种植与牧草生产之间的平衡,这将给我国的粮食安全和畜牧业发展带来巨大的好处。采用生物技术分离抗逆基因,通过转基因方法提高苜蓿的抗逆性是培育苜蓿新品种的有效途径。本研究以农杆菌侵染法将从水稻中克隆得到的OsAPX2基因转化紫花苜蓿,将bar基因作为选择标记,获得了耐盐性明显增强的转基因植株。主要研究结果如下：1.将抗坏血酸过氧化物酶（OsAPX2）基因导入紫花苜蓿从水稻中克隆了OsAPX2基因,构建了含有OsAPX2基因的植物表达载体OsAPX2-pCAMBIA3301,该载体由35S启动子驱动,以bar基因为选择标记。通过农杆菌侵染法将OsAPX2基因导入到紫花苜蓿中,获得了22个独立株系再生植株。2.转基因植株的分子鉴定对上述22个转基因株系喷洒5‰的Basta溶液,喷施试验表明大部分转基因植株正常生长,叶片能够保持绿色,而野生型植株则叶片枯黄,甚至死亡。通过PCR、Southern Blot和RT-PCR对这22个独立株系在分子水平上进行了鉴定,在20个独立株系中能够扩增出OsAPX2基因的特异片段,不同株系之间的拷贝数略有不同,该基因在紫花苜蓿中得到了有效的表达,且各株系之间的表达量不同。3.转基因植株的耐盐性鉴定对转OsAPX2基因紫花苜蓿进行了盐胁迫。在200 mM NaCl的盐胁迫条件下,转基因植株表现出了良好的耐盐能力,盐胁迫25d时,转基因植株叶片仍能够保持绿色,仅部分叶片开始枯萎,而此时野生型植株整体表现枯萎。复水后野生型植株无法恢复,而转基因植株能够恢复,且植株整体长势良好。4.转基因植株耐盐生理生化指标的测定检测结果表明盐胁迫25d后,转基因植株的叶片相对含水量和叶绿素含量均明显高于野生型植株,脯氨酸含量也明显高于野生型植株,且增幅明显,而转基因植株中的电解质渗漏率、丙二醛（MDA）含量和过氧化氢含量（H2O2）则明显低于野生型植株,说明过量表达抗坏血酸过氧化物酶（APX）的转基因植株能够更有效的解除ROS的毒害,提高植株的耐盐性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 紫花苜蓿概述
• 1.2 抗坏血酸过氧化物酶基因研究进展
• 1.2.1 活性氧和活性氧在植物体内的作用
• 1.2.2 植物体内活性氧的清除机制
• 1.2.3 抗坏血酸过氧化物酶在清除活性氧过程中的作用
• 1.2.4 抗坏血酸过氧化物酶的分布和亚细胞定位
• 1.2.5 水稻中的APX基因
• 1.2.6 抗坏血酸过氧化物酶APX的转基因研究
• 1.3 转基因紫花苜蓿的研究进展
• 1.3.1 非生物胁迫
• 1.3.2 抗病虫性
• 1.3.3 抗除草剂
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 根癌农杆菌介导的OsAPX2基因转化紫花苜蓿
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 植物培养基
• 2.1.5 农杆菌菌株及其携带的质粒
• 2.1.6 农杆菌培养基
• 2.1.7 主要实验仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 农杆菌的保存
• 2.2.2 种子灭菌和无菌苗的培养
• 2.2.3 外植体的准备
• 2.2.4 农杆菌侵染
• 2.2.5 抗性愈伤组织
• 2.2.6 愈伤组织的分化
• 2.2.7 生根培养
• 2.2.8 移栽
• 2.3 实验结果
• 第三章 转基因紫花苜蓿的分子检测及表达分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试植株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 转基因植株的Basta筛选
• 3.2.2 转基因植株的PCR筛选
• 3.2.3 Southern Blot检测
• 3.2.4 RT-PCR检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 再生植株的Basta筛选
• 3.3.2 转基因植株的PCR鉴定
• 3.3.3 OsAPX2基因在转基因苜蓿中的表达量
• 3.3.4 转基因植株的PCR-Southern Blot
• 第四章 转基因植株的耐盐性分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料的准备
• 4.1.2 盐胁迫处理
• 4.2 生理指标的测定
• 4.2.1 叶片相对含水量
• 4.2.2 叶绿素含量的测定
• 4.2.3 电解质渗透率
• 4.2.4 丙二醛含量
• 4.2.5 脯氨酸含量的测定
• 2O₂含量的测定'>4.2.6 H₂O₂含量的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 转基因植株的耐盐性鉴定
• 4.3.2 叶片相对含水量的变化
• 4.3.3 叶片叶绿素含量的变化
• 4.3.4 叶片电解质渗透率的变化
• 4.3.5 丙二醛（MDA）含量的变化
• 4.3.6 脯氨酸含量的变化
• 4.3.7 过氧化氢含量的变化
• 4.4 讨论
• 第五章 主要结论
• 5.1 全文结论
• 5.2 后续工作
• 参考文献
• 英文缩略表
• 在学期间的研究成果
• 致谢