奶山羊乳腺发育相关功能基因Rpl11的研究

论文摘要

随着生命科学的发展,研究领域的不断开拓,越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,研究这些未知新基因的功能和已知基因的新功能成为了极其重要的一项内容。本实验应用RACE技术扩增本实验室构建的Long-SAGE标签库中的与乳腺发育相关功能Rpl11基因。使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通过RT-PCR,将奶山羊乳腺组织中的mRNA反转录成cDNA,分别应用3′RACE和5′RACE扩增Rpl11基因的3′端和5′端。扩增产物TA克隆转化大肠杆菌,随机挑取阳性克隆后进行测序分析。通过序列比对、拼接,获得全长的Rpl11基因。对该序列进行生物信息学分析,Rpl11基因共编码246个氨基酸残基,氨基酸序列通过NCBI BLAST工具进行同源性分析,同源性最高的是Bos（Rpl11mRNA同源性为95%）,其次为Sus（Rpl11 mRNA同源性为93%）,再次为Hs（Rpl11 mRNA同源性为91%）。根据质粒介导的RNA干扰效应对Rpl11基因表达的抑制作用,研究基因功能。合成针对Rpl11基因的小发夹RNA表达载体,将shRNA表达载体和pIRES2-EGFP增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染奶山羊乳腺上皮细胞,针对无关序列的shRNA表达载体为阴性对照,荧光定量RT-PCR技术检测细胞Rpl11基因的抑制效果。特异性shRNA表达载体可以抑制Rpl11基因在乳腺上皮细胞中的表达,以及与乳腺发育相关激素受体Esr、Pgr基因的表达。实验结果表明,瞬时转染48h后,与阴性对照组相比,转染组Rpl11 mRNA表达量被显著抑制（p<0.05）,阴性对照组和空白对照组间差异不显著。稳定转染30d,转染组Rpl11 mRNA表达量也显著低于阴性照组（p<0.05）,阴性对照组和空白对照组间差异不显著（p>0.05）。应用PCR方法扩增Rpl11基因全长,在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入Rpl11基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-Rpl11。脂质体转染奶山羊乳腺上皮细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株,确定了G418对乳腺上皮细胞的最小致死浓度为500μg/mL。应用荧光定量RT-PCR技术检测细胞Rpl11基因表达量,以及与乳腺发育相关激素Esr、Pgr基因的表达量变化,结果表明,瞬时转染48h后超表达组Rpl11 mRNA表达量极显著增加（p<0.05）,阴性对照组和空白对照组间差异不显著（p>0.05）。稳定转染30d后,超表达组Pgr、Esr mRNA表达量显著增加（p<0.05）,阴性对照组和空白对照组间差异不显著（p>0.05）。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 奶山羊乳腺
• 1.1.2 奶山羊乳腺的结构
• 1.1.3 奶山羊乳腺的发育过程
• 1.1.4 乳腺功能变化与激素调控
• 1.2 基因功能研究的主要方法
• 1.2.1 基因打靶技术
• 1.2.2 基因敲除、基因敲入
• 1.2.3 转基因技术
• 1.2.4 基因沉默技术
• 1.2.5 基因捕获技术
• 1.2.6 微阵列分析
• 1.2.7 反义技术
• 1.3 Rpl11的概述
• 1.3.1 核糖体蛋白L11基因简介
• 1.3.2 Rpl11基因及其编码的蛋白质分子结构
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.4.1 研究的目的
• 1.4.2 研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 奶山羊乳腺组织总RNA提取
• 2.1.1 实验用品处理及主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验动物的选取
• 2.1.4 RNA提取的乳腺组织处理
• 2.1.5 RNA提取步骤
• 2.1.6 RNA质量检测
• 2.2 Rpl11基因的克隆与测序
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 奶山羊乳腺总RNA提取
• 2.2.3 c DNA的合成
• 2.2.4 管家基因Gapdh（3 磷酸甘油醛脱氢酶）验证
• 2.2.5 Rpl11基因扩增
• 2.3 奶山羊乳腺上皮细胞培养
• 2.3.1 实验试剂配制
• 2.3.2 主要实验仪器
• 2.3.3 获取细胞培养的乳腺组织
• 2.3.4 奶山羊乳腺上皮细胞原代培养步骤
• 2.3.5 奶山羊乳腺上皮细胞的传代及纯化
• 2.3.6 奶山羊乳腺上皮细胞冻存与复苏
• 2.4 Rpl11基因沉寂检验基因功能
• 2.4.1 主要试剂
• 2.4.2 主要仪器
• 2.4.3 Rpl11基因沉寂对奶山羊乳腺上皮细胞的影响
• 2.5 真核表达载体p IRES2-EGFP-Rpl11的构建
• 2.5.1 主要试剂
• 2.5.2 主要仪器
• 2.5.3 Rpl11基因引物设计
• 2.5.4 c DNA的合成
• 2.5.5 Rpl11基因全长PCR扩增
• 2.5.6 带粘性末端p IRES2-EGFP的质粒的制备
• 2.6 荧光定量RT-PCR检测相关基因表达
• 2.6.1 RNA干扰及超表达转染奶山羊乳腺上皮细胞RNA的提取
• 2.6.2 引物设计
• 2.6.3 反转录生成c DNA
• 2.6.4 荧光定量RT-PCR反应
• 2.6.5 Rpl11在m RNA转录水平表达的检测
• 2.7 转染对乳腺上皮细胞活性的影响
• 2.8 实验数据的统计分析
• 3 结果
• 3.1 Rpl11基因的3′5′RACE PCR扩增
• 3.1.1 奶山羊乳腺组织总RNA提取及检测
• 3.1.2 管家基因Gapdh（3 磷酸甘油醛脱氢酶）验证
• 3.1.3 3′5′ RACE PCR扩增
• 3.1.4 重组质粒酶切鉴定结果
• 3.1.5 质粒及菌液PCR验证
• 3.1.6 Rpl11基因3′5′RACE序列测定
• 3.1.7 Rpl11基因序列分析及系统进化树
• 3.2 奶山羊乳腺上皮细胞培养
• 3.2.1 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 3.2.2 奶山羊乳腺上皮细胞纯化与传代
• 3.3 转染检测结果
• 3.3.1 Rpl11基因有效干扰片段筛选结果
• 3.3.2 Rpl11基因沉寂后的荧光检测
• 3.3.3 稳定转染后细胞形态观察
• 3.3.4 转染后Rpl11 mRNA表达变化
• 3.4 超表达检测结果
• 3.4.1 真核表达载体pIRES2-EGFP-Rpl11构建
• 3.4.2 超表达对Rpl11 mRNA表达的影响
• 3.5 荧光定量RT-PCR检测奶山羊乳腺上皮细胞相关基因的表达
• 3.5.1 乳腺上皮细胞中Pgr基因相对表达量
• 3.5.2 乳腺上皮细胞中Esr基因相对表达量
• 3.6 转染对乳腺上皮细胞活性的影响
• 4 讨论
• 4.1 Rpl11基因扩增和真核表达载体的构建
• 4.1.1 Rpl11基因扩增
• 4.1.2 真核表达载体的构建
• 4.2 RNA干扰技术及基因过表达技术
• 4.2.1 RNA干扰技术
• 4.2.2 基因过表达技术
• 4.3 Rpl11基因转染乳腺上皮细胞
• 4.3.1 转染方法的选择
• 4.3.2 转染条件的选择
• 4.3.3 G418筛选稳定转染细胞
• 4.3.4 荧光定量PCR技术
• 4.4 雌激素、孕酮激素及其受体对妊娠期奶山羊乳腺发育的影响
• 4.4.1 雌激素及其受体对妊娠期奶山羊乳腺发育的影响
• 4.4.2 孕酮激素及其受体对妊娠期奶山羊乳腺发育的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文