白色念珠菌磷脂酶与其毒力因子、耐药性及基因多态性的关系研究

论文摘要

背景与目的白色念珠菌的毒力因子主要包括：细胞表面粘附结构、利于侵入的酶(天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶)、表型转换等。宿主细胞膜中的主要成分磷脂,可被白色念珠菌分泌的磷脂酶所分解,白色念珠菌通过完整性受损的细胞膜侵入宿主细胞。目前,还不清楚磷脂酶和白色念珠菌其他毒力因子之间存在怎样的关系,因此,本实验检测临床分离的白色念珠菌磷脂酶活性,将其分为磷脂酶高活性组和磷脂酶低活性组,探讨磷脂酶与菌株其他毒力因子(溶血活性、细胞表面疏水性、粘附颊粘膜上皮细胞)、耐药性及基因多态性之间的关系,从而对深入了解磷脂酶在白色念珠菌致病性和耐药性中的作用提供实验依据,为抗真菌药物的研制及白色念珠菌的诊断和治疗奠定理论基础。方法采用蛋黄平板法对80株白色念珠菌的磷脂酶活性进行检测,以PZ值表示磷脂酶活性,根据菌株PZ值,选出磷脂酶活性较高和磷脂酶活性较低的菌株各10株,分为两组。比较两组的溶血活性、细胞表面疏水性、粘附颊粘膜上皮细胞能力的差异,分析白色念珠菌磷脂酶与上述三种毒力因子之间的关联性；同时进行药物敏感性检测,比较两组间耐药性的差异；提取菌株DNA,应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析两组的基因型特征。结果从临床分离的80株白色念珠菌中,78株可以分泌磷脂酶,磷脂酶阳性检出率为97.5%,其PZ值的范围为0.566～1.000,A组PZ均值为0.639±0.043,B组PZ均值为0.847±0.079,两组有显著性差异(p<0.05)。两组的溶血活性、细胞表面疏水性均无显著性差异(p>0.05),菌株磷脂酶活性与溶血活性、细胞表面疏水性均无直接关联(r=0.122,p>0.05)、(r=0.072,p>0.05)。而两组的粘附力有显著性差异(p<0.05),A组菌株对颊粘膜上皮细胞的粘附力显著强于B组,磷脂酶活性与粘附力呈正相关(r=0.773,p<0.01)。两组菌株对7种抗真菌药物的耐药性明显不同,A组中对益康唑耐药率为70%,对咪康唑、氟康唑、伊曲康唑也有中敏或者耐药情况；而B组中对益康唑耐药率仅为10%,对其余的6种药物均敏感。RAPD结果显示,除B组中两株磷脂酶阴性的菌株显示为独特的基因型外,剩余A、B两组菌株主要条带的数量和位置差异较小,在1300 bp处均显示一高亮度条带,在>1500 bp处各显示有3条亮带,遗传相似系数在0.500～1.000之间,两组菌株基因多态性无明显差异。结论临床分离的白色念珠菌多数可以产生磷脂酶,说明磷脂酶是白色念珠菌重要的毒力因子；其活性与菌株的粘附力有一定的相关性,但与菌株的溶血活性、细胞表面疏水性并没有直接的相关,磷脂酶活性不能直接反应菌株其他毒力因子的情况；磷脂酶活性高的菌株其耐药性也随之增强,表明磷脂酶和耐药有一定的相关性；基因多态性不能直接反应磷脂酶活性的强弱,说明基因多态性是对包括溶血活性、细胞表面疏水性、粘附力及耐药等特征的一个综合反映,不只简单地反映磷脂酶这一单一的毒力特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、前言
• 二、实验材料
• 1.菌株
• 2.培养基
• 3.颊粘膜上皮细胞
• 4.主要试剂
• 5.主要试剂盒
• 6.常用缓冲液
• 7.RAPD-PCR用溶液
• 8.主要仪器与设备
• 三、实验方法
• 1.白色念珠菌分离与鉴定
• 1.1.形态学观察
• 1.2.芽管生成实验
• 1.3.厚膜孢子形成实验
• 2.磷脂酶活性测定
• 2.1.菌悬液的制备
• 2.2.磷脂酶活性测定
• 2.3.结果测定
• 3.其他毒力因子测定
• 3.1.溶血活性测定
• 3.2.细胞表面疏水性测定
• 3.3.粘附性测定
• 4.耐药性测定
• 5.遗传特征测定
• 5.1.基因组DNA的提取
• 5.2.RAPD-PCR
• 6.统计学处理
• 四、实验结果
• 1.白色念珠菌分离与鉴定结果
• 2.磷脂酶活性测定
• 3.溶血活性检测
• 4.细胞表面疏水性
• 5.粘附性测定
• 6.药敏实验结果
• 7.RAPD-PCR结果
• 五、讨论
• 六、结论
• 七、参考文献
• 八、综述
• 1.细胞表面粘附结构
• 1.1.宿主细胞上或细胞外粘附分子
• 1.2.白色念珠菌细胞表面粘附结构
• 1.3 白色念珠菌粘附素家族
• 2.利于侵入的酶
• 2.1 天冬氨酸蛋白酶（SAP）
• 2.2 磷脂酶（PL）
• 3.表型转换
• 4.检索文献
• 九、攻读学位期间发表的学位论文
• 十、致谢
• 十一、附图