凉血化瘀方对湿性年龄相关性黄斑变性的治疗观察及实验研究

论文摘要

目的:1.评价激光诱导棕色挪威（brown norway,BN）大鼠脉络膜新生血管（choroidalneovascularization,CNV）模型的可行性,并从荧光素眼底血管造影（fundus fluoresceinangiography,FFA）、脉络膜铺片血管定量分析、病理、血管内皮细胞免染色疫组化法进行多方面比较。2.观察评价实验性脉络膜新生血管中血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor,VEGF）与色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）的表达水平及相互关系。3.观察凉血化瘀方对激光诱导的BN大鼠CNV形成的抑制作用,从FFA检查、脉络膜铺片血管定量分析、病理、血管内皮细胞染色免疫组化法、VEGF与PEDF蛋白表达水平方面进行多方位评价。4.观察凉血化瘀方治疗湿性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）患者的临床疗效,评价指标有:视力、FFA检查、眼底出血面积、渗出面积、累积损害面积、黄斑视网膜厚度、黄斑区总容积。方法:1.对4组24只BN大鼠单眼进行氪激光视网膜光凝,围绕视盘等距光凝20个激光斑,诱导CNV形成。激光功率360mW,光斑直径50μm,曝光时间0.05s。分别在光凝后1w、2w、3w、4w进行眼底彩照和FFA检查。在上述时间点各取2只大鼠进行脉络膜铺片定量分析血管面积;余4只处死,取眼球做石蜡切片,观察激光斑病理改变,FⅧR:Ag（FactorⅧ-Related Antigen,Ⅷ因子相关抗原）免疫组化法对新生血管进行半定量分析。2.通过石蜡切片观察CNV发展的4w时间内,不同时间点CNV中细胞因子VEGF和PEDF的蛋白表达。3.对3组48只BN大鼠行氪激光光凝,建立CNV动物模型,其中1组作为空白组,1组造模后玻璃体腔注射曲安奈德做为对照组,1组造模后予以凉血化瘀方灌胃作为中药组。分别在光凝后1w、2w、3w、4w行FFA检查。在上述各时间点处死各组动物4只,其中1只行异硫氰酸荧光素葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate dextran,FITC-D）灌注、脉络膜铺片定量新生血管面积,余3只摘出眼球,制作石蜡切片,观察不同时间点CNV的中FⅧR:Ag、VEGF、PEDF表达的变化,并进行半定量检测。4.观察临床确诊为CNV型AMD的患者90例患者109眼,予以口服凉血化瘀中药治疗。连续观察6个月,总结视力,眼底出血面积、渗出面积、累积损害面积、OCT检查结果。分析比较治疗前后视力、眼底出血、渗出、累积损害面积、黄斑视网膜厚度和黄斑区总容积变化,并观察用药过程中不良反应。结果:1.在4w时间内,FFA检查、脉络膜铺片血管面积测量、病理切片、FⅧR:Ag因子免疫组化结果显示,实验性CNV在1w～3w期间呈持续性增殖（P＜0.05）,到4w时稳定。2.在实验性CNV形成的过程中,VEGF蛋白表达明显增加、PEDF蛋白表达明显下降（P＜0.05）。3.凉血化瘀方治疗CNV组,FFA检查测量荧光渗漏面积可见3w～4w时,中药组CNV的荧光渗漏面积明显小于空白组和对照组（P＜0.05）;脉络膜铺片新生血管面积测量可见4w时CNV面积明显小于空白组和对照组（P＜0.05）;FⅧR:Ag因子和VEGF蛋白表达可见4w时中药组阳性反应物IOD值小于空白组和对照组（P＜0.05）,而PEDF蛋白表达在1w～4w时则明显增加（P＜0.05）。4.凉血化瘀方治疗湿性AMD患者3月后,视力提高25眼（22.94%）,稳定74眼（67.89%）,降低10眼（9.17%）;治疗6月后,视力提高32眼（29.36%）,稳定60眼（55.05%）,降低17眼（15.60%）,低视力组患者视力提高和稳定程度均好于高视力组。治疗3、6个月后患者眼底出血面积、渗出面积、累积损害面积、黄斑视网膜厚度、黄斑区总容积改变无统计学意义。结论:1.激光诱导的BN大鼠CNV模型,与人类AMD的CqqV在发生、发展和病理基础上基本一致,是目前研究湿性年龄相关性黄斑变性的良好模型。2.FFA检查可确定CNV的生成,通过对CNV渗漏面积的统计,可半定量估算新生血管的生长情况。FITC-D血管灌注的脉络膜铺片法可保留CNV的原始形态,具有易观察性,并可做客观的定量统计,是研究CNV的可靠方法。FⅧR:Ag可标记血管内皮细胞,是判定CNV存在的有效方法。3.实验性CNV中VEGF的表达上调、PEDF表达下降,二者呈明显负相关关系。4.通过脉络膜血管铺片测量CNV面积、FFA检查、病理、免疫组化检查可观察到,凉血化瘀方可以显著抑制实验性脉络膜新生血管的生长,下调VEGF、上调PEDF蛋白表达水平。5.凉血化瘀方治疗湿性AMD患者在6个月观察期内具有一定的保持视力稳定和提高作用,能使眼底出血、渗出、累积损害和水肿瘢痕情况稳定;不良事件发生率低;是治疗湿性AMD患者的安全有效方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 激光诱导的实验性脉络膜新生血管模型
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 实验动物
• 3 方法
• 3.1 建立CNV动物模型
• 3.2 眼底彩照、FFA检查和分析
• 3.3 脉络膜铺片法测量CNV面积
• 3.4 取材
• 3.5 光镜标本制备及其观察方法
• 3.6 FⅧR:Ag免疫组化检测
• 4 结果
• 4.1 大鼠眼底彩照和FFA结果
• 4.2 大鼠视网膜病理学检查结果
• 4.3 大鼠视网膜FⅧR:Ag免疫组化染色结果
• 4.4 大鼠脉络膜血管铺片评价新生血管面积
• 4.5 大鼠FFA检查测量CNV荧光渗漏面积统计结果
• 4.6 BN大鼠模型CNV发生率
• 5 讨论
• 5.1 实验性脉络膜新生血管动物模型的选择
• 5.2 大鼠脉络膜血管铺片技术的评价
• 5.3 大鼠FⅧR:Ag染色的意义
• 6 结论
• 第二部分 VEGF、PEDF在实验性大鼠脉络膜新生血管中的表达及意义
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 实验动物
• 3 方法
• 3.1.建立CNV动物模型
• 3.2 取材及固定
• 3.2 脱水、透明、浸蜡、包埋
• 3.3 组织石蜡切片
• 3.4 VEGF免疫组化染色方法
• 3.5 PEDF免疫组化方法
• 3.6 观察、采集数字图片
• 3.7 数据统计
• 4.结果
• 4.1 VEGF免疫组化结果
• 4.2 PEDF免疫组化结果
• 4.3 VEGF与PEDF蛋白表达的相关性分析
• 4.4 VEGF、PEDF表达与CNV生长的相关性
• 5 讨论
• 5.1 CNV中VEGF表达异常的意义
• 5.2 CNV中PEDF表达异常的意义
• 5.3 VEGF和PEDF表达相关性分析
• 6 结论
• 第三部分 凉血化瘀方抑制实验性脉络膜新生血管的实验研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 实验动物
• 3 方法
• 3.1 CNV动物模型的建立
• 3.2 对照组的建立
• 3.3 中药组的建立
• 3.4 大鼠眼底彩照、FFA检查和分析
• 3.5 大鼠脉络膜血管铺片法测量CNV面积
• 3.6 取材
• 3.7 大鼠视网膜光镜标本制备及其观察方法
• 3.8 大鼠FⅧR:Ag因子免疫组化检测
• 3.9 大鼠VEGF免疫组化染色方法
• 3.10 大鼠PEDF免疫组化方法
• 3.11 观察、采集数字图片
• 3.12 统计分析
• 4 结果
• 4.1 眼底彩照及FFA检查结果
• 4.2 病理学检查结果
• 4.3 大鼠脉络膜铺片血管灌注结果
• 4.4 FⅧR:Ag免疫组化结果
• 4.5 VEGF免疫组化结果
• 4.6 PEDF免疫染色结果
• 5 讨论
• 5.1 中医眼科对脉络膜新生血管性眼病的认识
• 5.2 凉血化瘀药物的现代研究
• 5.3 凉血化瘀方抑制实验性脉络膜新生血管的分子机制
• 6 结论
• 第四部分 凉血化瘀方治疗年龄相关性黄斑变性（湿性）临床疗效观察
• 1 目的
• 2 研究对象
• 2.1 纳入标准
• 2.2 排除标准
• 3 研究方法
• 3.1 研究药物
• 3.2 研究设备
• 3.3 观察指标及评价方法
• 4 研究结果
• 4.1 一般情况
• 4.2 视力改善情况
• 4.3 患者视力的转归特点
• 4.4 眼底出血面积变化
• 4.5 眼底渗出面积变化
• 4.6 眼底累积损害面积
• 4.7 黄斑区视网膜厚度与黄斑总容积
• 4.8 凉血化瘀方全身不良反应
• 4.9 典型病例举例
• 5 讨论
• 5.1 中医眼科对年龄相关性黄斑变性的治疗的认识
• 5.2 西医对湿性年龄相关性黄斑变性的治疗
• 5.3 凉血化瘀方治疗湿性年龄相关性黄斑变性的特点
• 6.结论
• 结语
• 不足和展望
• 参考文献
• 在学期间发表论文、参编专著、课题及获奖情况
• 附录 缩略词表
• 附录 综述
• 致谢