肺内源性/外源性因素致急性肺损伤机制研究

论文摘要

目的急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由于肺内、外各种病因导致的以急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭为主要表现的综合征。从病因上可将ALI/ARDS分为肺内因素（如吸人性肺炎）及肺外因素（严重休克、脂肪栓塞）两类。国内外学者认为肺内因素性ALI及肺外因素性ALl的差异可能对ALI的研究及治疗带来深远的影响。我们采用大肠杆菌气管注入性肺炎作为肺内源性ALI模型,油酸静脉注射作为肺外源性ALI模型,以此进行对比研究其病理、病理生理、体内促炎介质、抗炎介质及一氧化氮合酶的变化,观察他们的变化差异,为进一步研究治疗ALI提供实验及理论依据。方法1.材料及仪器新西兰大白兔27只,体重2.5-3.0kg,雄雌不拘,中国医科大学实验动物部提供;大肠杆菌（25922标准株）:中国医科大学附属第一医院细菌室提供;血气分析仪（瑞士AVL OMNI V）,HP便携式监护仪,Bear 1000 t/es型呼吸机,电子菌液比浊仪,SUNRIS型酶标仪;肌松剂:维库溴胺,麻醉剂:20%乌拉坦;TNF、IL-6放免试剂盒,IL-10 ELISA试剂盒,iNOS、eNOS免疫组化试剂盒,即用型SABC试剂盒。2.细菌悬液的制备（1）将大肠杆菌菌种接种于肉汤琼脂培养基上,37℃培养24h,取菌落分装于无菌试管中,-20℃冰箱备用。（2）将-2℃冰箱备用的大肠杆菌菌种接种于肉汤琼脂培养基上,37℃培养24h,取菌落混于无菌生理盐水中,用电子比浊仪调整菌液浓度,使菌液浓度为0.5麦氏浊度（此浓度相当于1×108cfu/ml）,取12ml（相当于12×108cfu）菌液在37℃水浴中备用。3.实验分组将大白兔随机分为四组,Ⅰ组:细菌注入组n=8,Ⅱ组:油酸静脉注射组n=8,Ⅲ组:生理盐水气管注入组n=6,Ⅳ组:对照组n=5。4.动物模型制作4.1大肠杆菌气管注入模型制作动物称重后经20%乌拉坦（5ml/kg）腹腔麻醉后,将兔仰卧位固定在实验台上,分离出气管,切开气管置入内径4mm气管插管,以备连接呼吸机;颈外静脉置入4F的心导管,建立液体通道并通过压力换能器接监护仪,同时进行中心静脉压测定及采取静脉血标本;颈外动脉插管并通过压力换能器接监护仪进行血压（BP）,心率（HR）,心律监测及采取动脉血标本。Ⅰ组:将上述备用菌液12ml分为四次,3ml/次,共20min。通过气管插管分别采取仰卧位、左侧卧位、右侧卧位、俯卧位四个体位,注入气管。每隔1h采动脉血气,至氧合指数（PaO2/FiO2）≤300mmHg时,表示ALI模型制作成功,进行有关指标检测并终止实验;Ⅲ组:将预先37℃水浴的生理盐水12ml代替Ⅰ组菌液,余操作同Ⅰ组,7 h时进行有关指标检测并终止实验;Ⅳ组:未进行气管注入物质,其余操作同Ⅰ组,7 h时进行有关指标检测并终止实验。4.2大肠杆菌气管注入与油酸静脉致急性肺损伤的对比研究大白兔称重后经20%乌拉坦（5ml/kg）麻醉后,固定在实验台上,进行气管、颈外静脉、颈动脉插管,并通过压力换能器接HP便携式监护仪,进行有创BP,HR监测。Ⅰ组:将菌液12 ml分为四次,3ml/次,共20 min。经过气管插管分别四个体位,注入气管,每隔1h采动脉血气,至氧合指数（PaO2/FiO2）≤300mmHg,表示ALI模型制作成功,进行有关指标检测,留取血标本,并终止实验;Ⅱ组:颈外静脉缓慢推入油酸（0.08ml/kg）,20 min内推完,余操作参照Ⅰ组。Ⅳ组:未进行气管注入物质,其余操作同细菌组,7小时终止实验。5.指标监测:手术操作及仪器连接结束后0.5 h检测以下各项基础参数:收缩压（SBP）、舒张压（DBP）,中心静脉压,动脉及混合静脉血气分析,呼吸力学测定,取得基础参数后给予细菌（生理盐水,油酸）,持续监测血流动力学:SBP、DBP,HR、心律;以后每1 h采动脉血进行血气分析;实验结束前进行呼吸力学测定。（1）呼吸力学测定:静脉推注肌松剂维库溴胺0.4mg,抑制兔的自主呼吸,下食道气囊,将潮气量增加至15 ml/kg,呼吸频率降至10 b/min,峰流速降至5 L/min,通过调整吸气末暂停时间,以保持Ⅰ:E=1:2,此时压力-容积（P-V）曲线类似静态P-V曲线,根据此曲线呼吸机自动给出肺的顺应性（CL）,气道峰压（PIP）。（2）肺气体交换:从颈动脉插管取动脉血作血气分析,测定动脉血氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）。肺内分流（Qs/Qt）的测算:动脉血气分析测出PaO2,PaCO2,SvO2,血红蛋白（Hb）;从心导管取混合静脉血,测定混合静脉血氧分压（PvO2）,二氧化碳分压（PvCO2）和氧饱和度（SvO2）,按下列公式计算Qs/Qt:Qs/Qt=（CoO2-CaO2）/（CoO2-CvO2）,CcO2为肺泡毛细血管血氧含量,CaO2为动脉血氧含量,CvO2为混合静脉血氧含量,在吸100%氧时CcO2=PaO2×0.0031+Hb×1.34×SaO2。6.标本的处理在预定时间放血处死大白兔,将心肺联合取出胸腔,从腹侧和背侧观察大体标本的改变,右下叶进行支气管肺泡灌洗,4ml/次,共3次,灌洗液经3层纱布过滤后计算回收量,取一滴回收液于显微镜下进行白细胞计数,剩余标本于1200rpm 4℃条件下离心10 min,留取上清液,-70℃冷冻保存,用于蛋白含量及细胞因子TNF、IL-6、IL-10的测定。左肺下叶用4%的多聚甲醛灌注固定,置于4%的多聚甲醛浸泡24 h以上,常规脱水、包埋制成蜡块,连续4μm切片,用于苏木素-伊红（HE）染色及免疫组化染色。剪下右肺中叶,置于电子天平仪上称湿重（W）,然后置60℃恒温箱,48小时后称干重（D）,计算湿重/干重比值（W/D）。基础血清、结束血清标本-70℃冷冻保存,进行TNF、IL-6、IL-10的测定。7.检测方法7.1 BALF中蛋白含量:采用双缩脲法。7.2血清及BALF中炎性介质:TNF、IL-6采用放射免疫法、IL-10采用ELISA法检测。7.3病理标本:HE染色切片置于400倍光学显微镜下观测,并参照Kendra半定量评分标准,对肺泡、肺间质白细胞浸润,肺泡、肺间质水肿进行评分。7.4肺组织iNOS、eNOS免疫组化的检测:采用鼠抗兔iNOS、eNOS多克隆抗体和SABC染色法、DAB显色,然后置于400倍光学显微镜下观测,并参照Elia-N评分:结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分。8.统计学方法:数据采用均值±标准差（（?）±s）表示,利用SPSSI2.0统计软件分析。同组实验前后数据的比较采用配对t检验,组间均值比较采用单因素方差分析q检验,两因素之间的相关分析用bivariate分析,P＜0.05有统计学意义。结果1.气管内直接注入12×108cfu大肠杆菌6h左右,动物可出现典型的ALI病理、病理生理变化。2.给予生理盐水气管注入早期也出现一过性的低氧血症,但很快恢复;继续观察至7h,不再出现低氧血症,也不出现ALI其他病理、病理生理变化。3.细菌组大体见两肺组织充血、水肿,下叶比上叶明显,呈重力依赖性改变,病理改变以白细胞浸润为主;油酸组其大体见两肺组织弥漫充血、水肿,病理改变以肺泡及肺泡间隔水肿为主。细菌组肺顺应性下降,肺内分流增加,气道峰压增加有比油酸组相对更为严重的趋势,可能由于细菌组局部充血、细胞浸润所致气道及肺泡病变较重,而油酸组病变呈现弥漫性充血、水肿有关。4.大肠杆菌气管注入、油酸静脉注射所致ALI可导致TNF、IL-6升高;TNF与IL-6有着明显的正相关,二者共同加重了肺组织损伤。两组比较细菌组TNF、IL-6升高更明显。BALF/血清比值提示大肠杆菌气管注入致ALI以肺内局部炎症反应为主,油酸静脉注射所致ALI以全身炎症反应为主。5.大肠杆菌气管注入、油酸静脉注射所致ALI均可导致IL-10升高;IL-10与TNF呈正相关,提示二者共同作用介导着炎症的发展。大肠杆菌气管注入与油酸静脉所致ALI比较,其IL-10升高更明显。6.大肠杆菌气管注入与油酸静脉注射所致ALI,其肺组织iNOS的表达明显升高。大肠杆菌气管注入与油酸静脉注射所致ALI比较,其iNOS的表达升高更明显。7.大肠杆菌气管注入与油酸静脉注射所致ALI,其肺组织eNOS的表达下降不明显。1.气管内直接注入12×108cfu大肠杆菌6h左右,动物可出现ALI。2.大肠杆菌气管注入与油酸静脉注射所致ALI比较:血清及BALF中炎性细胞因子（TNF、IL-6、IL-10）、白细胞肺组织浸润、iNOS的表达均更明显。

论文目录

• 一、摘要
• 1.中文论著摘要
• 2.英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 论文一 大肠杆菌气管注入致兔急性肺损伤的实验研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.实验结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 论文二 兔肺内源性/外源性急性肺损伤细胞因子水平变化的实验研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.实验结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 论文三 兔内源性/外源性急性肺损伤时一氧化氮合酶变化的研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.实验结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 1.综述
• 2.在学期间科研成绩
• 3.致谢
• 4.个人简介