带鱼微卫星标记的开发和微卫星标记在牙鲆选择育种中的应用

论文摘要

中国沿海所产鱼类不下1500种,十之八九都是有经济价值的。带鱼(Trichiurus haumela)因其分布广、个体大、产量高而成为我国海产四大经济鱼类(黄花鱼类、鳓鱼类、带鱼类和鲐鲅鱼类)中非常重要的成员。带鱼广泛分布于全世界的温暖水域,我国东海,黄、渤海,南海和北部湾均产。但是,近年来由于过度捕捞、海洋污染以及海洋生态系统恶化,带鱼产量明显下降,更重要的是导致带鱼群体的遗传多样性降低。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国北方海水鱼类养殖业的主导,随着牙鲆人工养殖业的迅速发展,苗种需求量逐年增大。近年来,由于长期的人工选择和育种,致使牙鲆群体的遗传结构水平有所下降。分子标记技术为直接从DNA水平上认识生物个体遗传差异提供了强有力的工具,尤其是微卫星DNA分子标记技术,具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点,已经成为种群遗传学研究中被广泛应用的分子遗传标记。本文主要进行了三方面的工作,一是带鱼多态微卫星标记的开发；二是利用SSR标记进行牙鲆亲本遗传距离与后代生长速度相关性分析；三是利用SSR标记进行牙鲆家系鉴定和亲子关系分析。主要研究结果如下：1.带鱼多态微卫星标记的开发采用FIASCO (fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)方法构建了带鱼GT重复微卫星富集文库,通过克隆、测序得到68条序列含有微卫星重复序列,成功设计了36对微卫星引物,最终获得12个多态的微卫星位点。这将为带鱼的群体遗传结构、遗传多样性等遗传特性进一步的研究奠定基础。2.利用SSR标记进行牙鲆亲本遗传距离与后代生长速度相关性分析采用微卫星技术,选用21个多态性微卫星分子标记分析了牙鲆亲鱼群体(32尾)的遗传多样性,并计算亲本间的遗传距离,利用SPSS软件对牙鲆亲本遗传距离与后代生长速度的相关性进行分析。结果表明,该亲鱼群体平均观测杂合度(Ho)为0.6931,平均期望杂合度(He)为0.6784,平均多态信息含量(PIC)为0.6237。说明该亲鱼群体的遗传多样性水平比较高,对环境变化的适应能力较强,具有较高的选育潜力。研究发现,亲本间遗传距离分布在0.2578～0.9773范围之间,其中,在0.2578～0.5958范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的正相关(P<0.05)；在0.6099～0.6604范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度之间没有表现出显著的相关性；在0.6640～0.9773范围内,亲本间遗传距离与后代生长速度呈显著的负相关(P<0.05)。这将对培育生长速度快的牙鲆养殖品种,提高牙鲆养殖产品质量和经济效益具有重要的意义。3.利用SSR标记进行牙鲆家系鉴定和亲子关系分析利用8个高质量的微卫星DNA标记,对来源于9个家系(2007年建立)的180尾牙鲆个体进行了家系鉴定和亲子关系分析,同时分析了所用微卫星标记数目对牙鲆家系鉴定准确率的影响。结果表明：(1)子代群体与亲本群体相比,每个位点扩增的等位基因数减少了13.9%,Nei’s期望杂合度(1973)也有所减少(子代He=0.7702,亲本He=0.8044)。(2)9个家系共发现了14个家系特异等位基因：39#,61#和69#家系各有1个特异等位基因,36#和68#家系各有2个特异等位基因,47#家系发现了3个特异等位基因,82#家系发现了4个特异等位基因。(3)亲子关系分析为180尾后代中的148尾成功地找到了其“真实”的父母,同时表明,利用4个微卫星标记可以鉴定95%的后裔,5个标记则可以鉴定97%的后裔。表明微卫星分子标记可以作为牙鲆选择育种过程中获得系谱信息和确定亲子关系的一种有效方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 微卫星DNA标记技术概述
• 1.1 微卫星DNA标记技术的基本原理
• 1.2 微卫星DNA标记多态性分析的特点
• 1.2.1 微卫星DNA含量丰富、分布广泛而均匀
• 1.2.2 微卫星DNA标记具有丰富的多态性和信息量
• 1.2.3 微卫星DNA标记呈共显性遗传,遵循孟德尔遗传定律
• 1.2.4 微卫星DNA标记具有高度的保守性,通用性好
• 1.2.5 对DNA样品的质量要求不高
• 1.2.6 实验操作简单、结果稳定可靠
• 2 微卫星DNA标记的筛选方法
• 2.1 生物信息学法
• 2.2 种间转移扩增法
• 2.3 RAPD富集法
• 2.4 直接文库筛选法
• 2.5 引物法富集微卫星
• 2.5.1 单引物延伸富集法
• 2.5.2 基于锚定PCR技术的方法
• 2.6 杂交法富集微卫星
• 2.6.1 尼龙膜法
• 2.6.2 磁珠杂交法
• 3 微卫星DNA标记技术在水产动物中的应用
• 3.1 物种遗传多样性检测及鉴定
• 3.2 群体遗传结构分析
• 3.3 亲子鉴定及亲缘关系分析
• 3.4 遗传图谱构建
• 3.5 数量性状基因定位分析
• 3.6 鱼类种质资源的保护
• 4 本文研究的内容、目的和意义
• 第二章 带鱼微卫星DNA标记的开发及多态位点的筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 实验仪器设备
• 2.1.3 实验试剂和药品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 带鱼基因组DNA的提取
• 2.2.2 微卫星富集文库的构建及多态微卫星位点的筛选
• 2.2.2.1 基因组DNA的酶切
• 2.2.2.2 接头的制备及连接
• 2.2.2.3 连接产物预扩增
• 2.2.2.4 连接产物的二次扩增及扩增产物的回收纯化
• 2.2.2.5 扩增产物与生物素探针杂交
• 2.2.2.6 磁珠杂交及洗脱
• 2.2.2.7 洗脱片段的扩增及扩增产物的纯化
• 2.2.2.8 富集片段的克隆
• 2.2.2.9 阳性克隆的筛选及测序
• 2.2.2.10 序列特征分析及微卫星引物设计
• 2.2.2.11 多态性微卫星位点的筛选
• 2.2.2.12 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳
• 2.2.2.13 银染
• 2.2.3 数据统计及分析
• 3 实验结果
• 3.1 带鱼基因组DNA提取结果
• 3.2 带鱼基因组DNA酶切结果
• 3.3 预扩产物的检测
• 3.4 二次扩增产物的回收纯化结果
• 3.5 洗脱目的片段扩增产物纯化结果
• 3.6 阳性克隆鉴定结果
• 3.7 微卫星引物设计结果
• 3.8 多态性微卫星位点筛选结果
• 4 讨论
• 第三章 SSR标记在牙鲆亲本遗传距离与后代生长速度相关性分析中的应用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验鱼群体
• 2.1.2 微卫星DNA标记
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 牙鲆基因组DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 扩增产物检测
• 2.2.4 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 基因组DNA的电泳检测结果
• 3.2 32尾牙鲆亲鱼的遗传多样性分析
• 3.3 牙鲆亲本间遗传距离与后代生长速度的相关性分析
• 4 讨论
• 第四章 SSR标记在牙鲆家系鉴定和亲子关系分析中的应用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验鱼群体
• 2.1.2 微卫星DNA标记
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA的提取
• 2.2.2 微卫星分析
• 2.2.3 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 遗传多样性分析
• 3.2 家系鉴别
• 3.3 九个牙鲆家系的亲子关系分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文