过氧化物酶和谷胱甘肽的单细胞分析及DNA的单分子检测

论文摘要

第一章主要对毛细管电泳、微流控芯片和扫描电化学显微镜的单细胞分析及单细胞高通量分析作了简要的综述。在毛细管电泳单细胞分析中，涉及到单细胞进样，细胞溶膜，细胞内组分的衍生（包括柱前衍生，柱上衍生，柱后衍生）和检测技术（包括电化学法和激光诱导荧光法）。此外对细胞内衍生技术及细胞电穿孔技术在毛细管电泳单细胞分析中的应用也作了叙述。在微流控芯片单细胞分析中，着重介绍了单细胞组分分析及单细胞内生化反应的实时检测。本章也对扫描电化学显微术在单细胞分析中的应用及高通量单细胞分析也作了概述。本章共引用文献142篇。 第二章中我们提出了一种文献中未见报道的高通量电化学测定单个细胞中酶的新策略。首先利用毛地黄皂苷能溶解细胞膜上胆固醇的性质，使细胞膜上形成微孔，只有小分子物质（如酶的底物和产物）可以通过这些微孔进出细胞，而大分子物质（如酶）不能穿过细胞膜。在毛细管中加入缓冲液和酶反应的底物氢醌（H2Q）和过氧化氢（H2O2）。用压力将细胞逐个连续压入毛细管，H2Q和H2O2通过细胞微孔扩散进入细胞与酶发生催化反应。生成的苯醌（BQ）又扩散出细胞。细胞随着压力流向检测端移动，与此同时，在细胞周围形成产物BQ的区带，当区带到达毛细管出口时，用碳纤维电极检测。我们用这种方法成功地测定了人中性粒细胞中过氧化物酶。在32min内可连续测定39个细胞。通过分析得到方法的相对标准偏差RSD为8.7％。其中细胞不同造成的RSD约为6％。该论文发表在Anal．Chem．78（2006），3213-3220。 在第三章，我们建立了一种纳升微池中催化反应电化学检测单细胞中酶活性的方法。在这个方法中将单细胞用推片的方法导入到用简单的化学方法刻蚀的纳升微池阵列中。再将此细胞用冷冻/解冻方法溶膜。在含有单细胞溶解液的微池中加入酶反应的底物。在反应10min后插入用微米金圆盘工作电极和Ag/AgCl参比电极构建成的双电极。用伏安法测定单细胞中的酶。整个实验在自制的恒湿箱中进行。此外，文中还讨论了溶液蒸发、电极尺寸、溶液体积、电极污染、单细胞微池加样、溶液中溶解氧的影响等因素。用这种方法成功的测定了人单个中性粒细胞和急性早幼粒白血病细胞中的过氧化物酶活性。该论文发表在Anal

论文目录

• 符号与缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 单细胞分析
• 1.1 引言
• 1.2 毛细管电泳单细胞分析
• 1.2.1 进样
• 1.2.2 细胞衍生
• 1.2.2.1 柱前衍生
• 1.2.2.2 柱上衍生
• 1.2.2.3 柱后衍生
• 1.2.2.4 细胞内衍生
• 1.2.2.5 细胞电穿孔技术
• 1.2.3 细胞溶膜
• 1.2.4 检测技术
• 1.2.4.1 电化学法
• 1.2.4.2 激光诱导荧光法
• 1.3 微流控芯片单细胞分析
• 1.3.1 单细胞组分分析
• 1.3.2 单细胞内生化反应的实时检测
• 1.3.3 其它方面的工作情况
• 1.4 扫描电化学显微镜单细胞分析
• 1.4.1 仪器装置
• 1.4.2 工作原理
• 1.4.2.1 正反馈模式
• 1.4.2.2 产生/收集模式
• 1.4.3 在单细胞研究中的应用
• 1.5 单细胞的高通量分析
• 1.6 单细胞分析的其它方法
• 1.7 展望
• 1.8 参考文献
• 第二章 高通量电化学检测单个中性粒细胞中过氧化物酶
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 高通量电化学单细胞分析
• 2.2.3.2 碳纤维束微盘电极的制作
• 2.2.3.3 毛细管的动态修饰
• 2.2.3.4 细胞的提取、蚀孔及细胞提取液的制备
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 细胞的蚀孔情况
• 2.3.2 细胞蚀孔后情况
• 2.3.3 细胞孵育时间的选择
• 2.3.4 细胞进样浓度的选择
• 2.3.5 高通量单细胞分析
• 2.3.6 中性粒细胞中PO的定量
• 2.3.6.1 电泳缓冲液添加剂精胺浓度的选择
• 2.3.6.2 细胞提取液中PO的定量测定
• 2.3.6.3 高通量中性粒细胞单细胞分析中PO的定量
• 2.3.6.4 误差讨论
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 微池中伏安法双电极测定单细胞中酶的活性
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 材料与试剂
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 双电极的制作
• 3.2.3.2 中性粒细胞的提取和细胞提取液的制备
• 3.2.3.3 微量加样器的制作与使用
• 3.2.3.4 微型电解池的制作
• 3.2.3.5 细胞提取液和 HRP标准曲线的测定
• 3.2.3.6 单细胞分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 双电极的表征
• 3.3.2 微量加样器的重现性
• 3.3.3 HRP的线性范围、检测限和重现性
• 3.3.4 细胞提取液中PO的测定
• 3.3.5 单细胞分析中溶液体积的确定
• 3.3.6 复合电极在单细胞分析中的重现性
• 3.3.7 单细胞中PO的测定
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 第四章 扫描电化学显微术定量测定单细胞中的过氧化物酶
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 材料与试剂
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 超微注射
• 4.2.3.2 定量测定单细胞中的PO活性
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 加液器的精度
• 4.3.2 单细胞中PO活性的SECM扫描曲线
• 4.3.2.1 细胞贴壁及细胞浓度
• 4.3.2.2 探头距基地距离对测定扫描曲线的影响
• 4.3.2.3 细胞内PO活性随时间的变化
• 4.3.3 单细胞中PO的定量测定
• 4.3.3.1 细胞超微注射时补偿压力的选择
• 4.3.3.2 单细胞超微注射的定量
• 4.3.3.3 细胞内标准加入法定量测定单细胞中的PO
• 4.4 结论
• 4.5 参考文献
• 第五章 用于扫描电化学显微术单细胞双信息的纳、微米双电极的制作及表征
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 材料与试剂
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 双金（铂）微纳米电极的制作
• 5.2.3.2 胃癌细胞的培养及固定
• 5.2.3.3 中性粒细胞的提取及固定
• 5.2.3.4 细胞形貌的测量
• 5.2.3.5 细胞呼吸活性的测量
• 5.2.3.6 中性粒细胞中PO活性的扫描
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 电极的表征
• 5.3.1.1 扫描电镜图
• 5.3.1.2 循环伏安法
• 5.3.2 单细胞信息的测量
• 5.3.2.1 细胞形貌的测量
• 5.3.2.2 呼吸活性的测量
• 5.3.2.3 中性粒细胞中过氧化物酶（PO）活性的测量
• 5.3.3 用双电极测量单细胞双信息的可能性
• 5.4 结论
• 5.5 参考文献
• 第六章 高通量微流控芯片检测单细胞中的谷胱甘肽
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验仪器
• 6.2.2 材料与试剂
• 6.2.3 实验方法
• 6.2.3.1 PDMS芯片的制作与修饰
• 6.2.3.2 细胞的准备
• 6.2.3.3 细胞中GSH的衍生及芯片中细胞的连续运行
• 6.2.3.4 细胞提取液的制备
• 6.2.3.5 GSH标准溶液和细胞提取液中GSH的测量
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 光源的选择
• 6.3.2 GSH的线性范围、检测限和重现性
• 6.3.3 细胞提取液中GSH的检测
• 6.3.4 高通量单细胞中GSH的测定
• 6.3.4.1 连续拍摄条件的选择
• 6.3.4.2 高通量单个胃癌细胞中GSH的定量
• 6.4 结论
• 6.5 参考文献
• 第七章 共聚焦激光扫描荧光图像的校正和胃癌细胞内谷胱甘肽的分布
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 实验仪器
• 7.2.2 材料与试剂
• 7.2.3 实验方法
• 7.2.3.1 细胞的培养和处理
• 7.2.3.2 细胞贴壁用小池的制作
• 7.2.3.3 罗丹明6G浸入胃癌细胞的方法及细胞的贴壁
• 7.2.3.4 细胞的贴壁及细胞内GSH的衍生
• 7.2.3.5 细胞内罗丹明6G及GSH激光共聚焦XYZ扫描成像
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 GSH衍生溶液的选择
• 7.3.2 胃癌细胞中GSH图像
• 7.3.3 共聚焦激光扫描图像中荧光强度的校正
• 7.4 结论
• 7.5 参考文献
• 第八章 基于体积放大的DNA单分子检测
• 8.1 引言
• 8.2 实验部分
• 8.2.1 实验仪器
• 8.2.2 材料与试剂
• 8.2.3 实验方法
• 8.2.3.1 微球及磁球的预处理
• 8.2.3.2 DNA的单分子检测
• 8.2.3.3 微球与生物素-ALP的反应及电化学毛细管电泳检测
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 理论分析
• 8.3.2 单分子 DNA检测
• 8.3.3 连接 ALP的微球的毛细管电泳电化学检测
• 8.4 结论
• 8.5 参考文献
• 博士期间发表的论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表