论文摘要
糖尿病（Diabetes millitus，DM）是一种复杂的代谢性疾病，且目前在我国已成为一个重大的公共卫生问题，调查显示其标准化年龄的患病率为9.7%。研究发现糖尿病患者发生脑卒中的几率较正常人增加1.5至3倍，也使卒中的复发率增加1倍，同时糖尿病可增加中风患者的死亡率和致残率。因此如何治疗糖尿病合并脑卒中成为关注的焦点。脂联素（adiponectin, APN）是主要由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子，血浆含量较高。APN主要功能片段位于C末端的球状区域，即所谓的球状脂联素（globularadiponectin，gAD）。APN具有多种生物学功能如调节糖脂代谢、抗炎、抗凋亡等作用。动物研究表明，APN可减少DM小鼠心肌缺血-再灌注损伤，但APN对DM小鼠脑缺血-再灌注损伤作用，目前尚未知。本课题拟线栓法建立小鼠MCAO（大脑中动脉阻塞）模型，通过STZ（streptozotocin）腹腔注射诱导Ⅰ型糖尿病（type1diabetes，T1DM）模型，观察gAD对正常小鼠脑缺血再灌注的保护作用及其机制，并进一步研究gAD对Ⅰ型糖尿病小鼠的脑保护作用，从而为临床治疗缺血性脑卒中及糖尿病合并脑卒中患者提供可靠的理论基础和实验依据。第一部分：球状脂联素对正常小鼠脑缺血损伤的保护作用及其抗凋亡机制的研究目的：近来有研究表明脂联素可减少脑缺血损伤。脂联素的主要功能片段位于C末端的球状区域，即所谓的球状脂联素（globular adiponectin，gAD），但有关其保护机制目前尚未清楚。氧化应激损伤在缺血-再灌注损伤中重要的机制之一，NADPH氧化酶2（NADPH oxidase2， NOX2）是体内ROS （氧自由基）的主要来源，因此本实验的目的：1、研究gAD对脑缺血损伤的作用及其抗氧化的影响2、研究NOX2是否参与gAD的抗氧化和抗凋亡作用方法：1、gAD脑保护作用及其对抗氧化的影响成年雄性C57BL/6小鼠行MCAO模型诱导脑缺血。随机分为Sham组；MCAO组，缺血90min后再灌注24h；gAD组，缺血前30min行侧脑室注射gAD；Vehicle组，溶剂组，即缺血前30min侧脑室注射同等体积的PBS。于再灌注24h后行行为学评分；脑梗死容积分析；抗氧化物酶SOD, catalase活性测定，MDA含量测定；TUNEL染色及凋亡阳性细胞计数；及凋亡相关蛋白Bcl2、Bax和活化caspase3的测定;同时采用western blot的方法观察NOX2的改变。2、NOX2激动剂对gAD脑保护及抗氧化能力的影响成年雄性C57BL/6小鼠行MCAO模型诱导脑缺血。随机分为MCAO组，缺血组，同前；gAD组，同前；gAD+TBCA （tetrabromocinnamic acid, TBCA，NOX2的激动剂）组，在gAD注射前30min行侧脑室注射TBCA；TBCA组，在MCAO前60min行侧脑室注射TBCA；Vehicle组，同前；DMSO组，TBCA的溶剂，给药时间及计量同TBCA组。于再灌注24h后行行为学评分；梗死容积分析；抗氧化物酶SOD, catalase活性测定，MDA含量测定。结果：1、gAD可减少脑缺血-再灌注损伤再灌注24h后发现，gAD组梗死容积显著低于MCAO组（P＜0.01， gAD vs.MCAO）,同时神经行为学也得到显著的改善，与MCAO组相比（P=0.028， gAD vs.MCAO）。MCAO组Vehicle组间无显著性统计学差异。2、gAD可减少缺血半暗带区细胞凋亡再灌注24h，gAD可以减少缺血后脑组织中TUNEL阳性细胞（P＜0.05，gAD vs.MCAO），减少组织中凋亡相关蛋白Bax/bcl2及cl-caspase3的表达（P＜0.05，gAD vs.MCAO）。MCAO组Vehicle组间无显著性统计学差异。3、gAD可增加MCAO机体抗氧化能力再灌注24h，gAD组血浆及组织中抗氧化物酶SOD与catalase活性均增加（P＜0.05，gAD vs. MCAO），MDA含量显著减少（P＜0.05，gAD vs. MCAO）。MCAO组Vehicle组间无显著性统计学差异。4、gAD可抑制MCAO后NOX2表达再灌注24h，gAD可减少MCAO后脑组织中NOX2的表达（P＜0.05， gAD vs.MCAO）。MCAO组Vehicle组间无显著性统计学差异。5、TBCA组可逆转gAD的脑保护作用给予NOX2激动剂TBCA可逆转gAD的脑保护及抗氧化能力作用。与gAD组相比，gAD+TBCA组神经行为学评分显著降低（P＜0.05，gAD vs. gAD+TBCA），脑梗死容积显著增加（P＜0.05，gAD vs. gAD+TBCA）；与gAD组相比，gAD+TBCA组血浆中及组织中SOD与catalase活性均降低（P＜0.05，gAD vs. gAD+TBCA），MDA含量明显增加（P＜0.01，gAD vs. gAD+TBCA）。结论：（1）gAD具有脑保护作用，且可减少缺血半暗带区神经元的凋亡。（2）gAD可通过增加机体抗氧化能力从而产生脑保护作用。（3）gAD通过下调NOX2的表达从而增强机体的抗氧化能力，最终发挥神经保护作用。第二部分：球状脂联素对Ⅰ型糖尿病小鼠脑缺血损伤的保护作用及其抗凋亡机制研究目的：1、gAD对T1DM小鼠脑缺血是否有脑保护作用2、gAD抑制T1DM小鼠脑缺血损伤后内质网应激的相关机制方法：T1DM采用腹腔注射低剂量STZ（streptozotocin, STZ），连续注射5天的方法诱导造模。从第一天注射算起，1周后测血糖高于13.3mmol/L则为造模成功，纳入实验，并从该时间点作为T1DM的0天，每周规律测动物血糖并称体重。1、I型糖尿病小鼠模型建立和血浆中APN的变化趋势T1DM采用腹腔注射低剂量STZ（streptozotocin, STZ），连续注射5天的方法诱导造模。从第一天注射算起，1周后测血糖高于13.3mmol/L则为造模成功，纳入实验，并从该时间点作为T1DM的0天，每周规律测动物血糖并称体重。同时通过ELASA方法测定不同病程小鼠脑组织中APN含量。2、 gAD对不同病程T1DM（2W和8W）小鼠脑缺血损伤的作用观察gAD（给药方法及剂量同第一部分实验）对两个时间点（T1DM-2W,8W）脑缺血/再灌注24h后观察神经行为学评分、脑梗死容积损伤的作用。3、AdipoR1参与gAD对T1DM小鼠脑缺血损伤的保护作用采用免疫荧光双标及western blot法测定T1DM-2W,8W组小鼠脑组织中AdipoRs的表达。分别于T1DM-2W组注射罗格列酮（RSG），T1DM-8W组转染AdipoR1-siRNA，进一步观察干扰AdipoR1表达后对gAD在T1DM小鼠脑缺血损伤作用中的影响。4、gAD通过AdipoR1抑制内质网应激减轻T1DM小鼠脑缺血损伤通过western blot法测定给予AdipoR1-siRNA或AdipoR1-siRNA（n）对各组小鼠MCAO后ERS相关伴侣蛋白表达的影响；采用透射电镜法观察ER显微结构；TUNEL染色法观察各组中细胞凋亡。结果：1、随着T1DM病程组织APN呈规律变化随着T1DM病程进展， APN呈现先增加后降低趋势，早期即T1DM-2W时血浆APN增加，后期T1DM-8W时APN下降；因此随后的研究我们选取2W和8W两个时间点。2、gAD对T1DM不同时期小鼠MCAO作用不同再灌注24h，gAD对T1DM-2W小鼠MCAO无保护作用，即与MCAO组相比，gAD组动物神经行为学评分无差别（P＞0.05，gAD vs. MCAO），脑梗死容积无差异（P＞0.05，gAD vs. MCAO）；然而结果显示，再灌注24h，gAD对T1DM-8小鼠MCAO具有神经保护作用，即与MCAO组相比，gAD组动物神经行为学评分显著改善（P＜0.05，gAD vs. MCAO），脑梗死容积明显减少（P＜0.05，gAD vs. MCAO）。3、T1DM早晚期小鼠脑组织中AdipoR1表达不同免疫荧光染色和western blot结果均显示，与Sham组相比，T1DM-2W小鼠脑组织中AdipoR1表达减少（P＜0.05，Sham vs. T1DM-2W）；而AdipoR2表达几乎无变化（P＞0.05，Sham vs. T1DM-2W）。随着DM病程增加，与T2DM-2W小鼠相比，T1DM-8W动物脑组织中AdipoR1表达增加（P＜0.05，T1DM-2W vs. T1DM-8W）；而AdipoR2表达两组间几乎无差异（P＞0.05，T1DM-2W vs. T1DM-8W）。4、调节AdipoR1表达可改变gAD在T1DM早晚期脑缺血中作用结果显示，T1DM-2W小鼠腹腔注射RSG（rosiglitazone，腹腔注射，2mg/kg，4h后行MCAO）可改善gAD对T1DM-2W小鼠脑保护作用，即与gAD组相比，RSG+gAD组小鼠再灌注24h后神经行为学评分减少（P＜0.05，gAD vs. RSG+gAD），脑梗死容积降低（P＜0.05，gAD vs. RSG+gAD）。T1DM-8W小鼠侧脑室注射AdipoR1特异性siRNA（0.3nmol/μ L，1.2nmol）可逆转gAD对T1DM-8W小鼠脑保护作用，即与gAD组相比，siRNA+gAD组小鼠再灌注24h后神经行为学评分明显增加（P＜0.05，gAD vs. siRNA+gAD），脑梗死容积显著增大（P＜0.05，gAD vs. siRNA+gAD）。5、gAD-AdipoR1通过抑制ERS-凋亡信号减少T1DM-8W脑缺血损伤T1DM-8W小鼠行MCAO，再灌注24h后，与缺血组相比，gAD组ERS伴侣蛋白GRP78表达增加（P＜0.05，gAD vs.MCAO），CHOP和caspase-12表达减少（P＜0.05，gAD vs.MCAO），脑缺血半暗带区TUNEL阳性细胞数目显著减少（P＜0.05，gAD vs.MCAO）；而给予AdipoR1特异性siRNA可以逆转gAD这一效应，即与gAD组相比，siRNA+gAD组GRP78表达明显减少，CHOP和caspase-12表达增加，同时伴随脑缺血半暗带区TUNEL阳性细胞数目大量增加。结论：（1）随着T1DM病程发展，APN在2W内逐渐增加，2W后逐渐少,且这一变化与AdipoR1改变密切相关，呈负相关。（2）gAD对早期T1DM-2W小鼠脑缺血无作用，而晚期T1DM-8W则有保护作用，且受AdipoR1表达水平调节。（3）gAD通过与AdipoR1结合，调节ERS的表达变化，进而影响神经元凋亡，最终发挥其在T1DM小鼠中枢保护作用。