模拟飞行实验对内皮细胞释放ET-1、HO-1及氧化应激的影响

论文摘要

研究背景飞行因素对飞行员心血管病的影响,是近年来航空医学的研究热点之一。无论是军事航空,还是民用航空都要求保证飞行安全第一。但军事航空较民航具有更多的特殊性,涉及军事作战。所以一旦出现事故,不仅造成人员伤亡,而且还会极大地妨害军事任务的完成。现代高性能战斗机具有持续高正加速度（+Gz）、高+Gz增长率等特点,对飞行员身体要求几乎达到机体的生理极限,因此容易受到低氧噪音和振动等因素影响而造成心理和生理应激。有研究报道,我国飞行人员30岁组动脉硬化指数达到一般人群40-50岁的水平,提示冠心病发病时间可能提早10-15年。国外相关研究显示,美国一组死于飞行事故的军事与民用航空飞行员调查发现,心血管异常的飞行员占43.82%,其中冠状动脉狭窄37.6%。波兰空军对229名飞行员检查,大多数飞行员有高脂血症,其中轻度40.6%、中度30.4%、严重7.4%,平均动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）指数大于5。很多研究显示正加速度暴露可能加速动脉粥样硬化的进程。动物实验研究显示,+Gz暴露可使高胆固醇饮食兔血清脂质代谢紊乱,提示正加速度暴露可能加速动脉粥样硬化的进程。重复高+Gz暴露,可导致大鼠心肌组织血管内皮细胞细胞间细胞黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）表达增多,其结果表明+G z致心肌损伤过程中,炎症反应不可避免的发生,可能会进一步加重+Gz导致的心肌损伤。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的决定性因素。因此战斗机飞行的高正加速度暴露,可能通过多种途径引起内皮细胞损伤,进而加速飞行员动脉粥样硬化进展。G即为一个地球表面的重力加速度,在航空中1G定义为航空机在海平面飞行时的升力和受到地球引力而往下吸引的力量相平衡时；而当飞行器改变惯性,如加减速或是进行非直线动作时即会产生正或负的G力。当飞行器加速或攀升,而导致重力由上往下,或进行非直线的动作的离心力,就会产生正G力,产生G力与地面位置无直接关系而与飞行器原有位置及方向有关,例如飞行器上下颠倒并往地面接近时,即使地面是在下方亦会产生正G力。相对的当飞行器减速或下降而使重力由下往上时,就会产生负G力,此时的上下亦与地面位置无直接关系。其实在生活中随时都会产生额外G力,但是多半因为过于微小因此往往被忽略,若要明显体验则可利用高速的器材或交通工具,例如云霄飞车或高速铁路,但此类方式所产生的G力仍旧在一般人体的可承受范围之内,而对于随时在进行超高速动作飞行器上的飞行员而言,G力却是不可忽视的一个重要关键,且往往决定生死。一般人体的基础+Gz耐力为4.0G左右,在有效的抗荷措施下可耐受+9.0Gz,已超过基础耐力的2倍以上。并且随着抗荷措施的不断发展,人体还可能短暂耐受更高的+Gz值而不出现晕厥。这种远远超过人体基础耐力的+Gz暴露,很可能会对人体组织产生不良影响或损伤。动物离心机是在地面模拟飞行（Simulated flight）试验中持续加速度的专用设备,可以准确控制+Gz值、+Gz增长率和作用时间及模拟空战动作的+Gz模式。在各种损伤因素作用下,内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生发展过程的关键始动环节,它既是感应细胞又是效应细胞,不仅能感知血液中的炎性信号、激素水平、切应力、压力等信息,而且能通过分泌多种血管活性物质对这些信息作出反应。氧化应激是指机体或细胞内以氧自由基为代表的氧化性物质的产生与消除失衡,或外源性氧化物质的过量摄入,导致氧化性物质在细胞内蓄积而易于引发氧化反应状态。氧化应激诱导内皮细胞损伤的机制非常复杂,主要表现为氧自由基的过氧化反应。由于自由基的反应引起细胞膜脂质过氧化、蛋白质和核酸变性,导致不可逆损伤。内皮氧化损伤是AS形成的始动因素,中膜平滑肌细胞增殖并迁移入内膜是其发展的重要因素。氧化应激在内皮细胞损伤所致动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用,它主要通过氧化作用、促进局部炎症反应、诱导血管基因的改变和参与影响信号转导途径等多方面参与动脉粥样硬化的发生发展过程。超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）是体内反应氧化应激的良好标志物。动脉粥样硬化早期的一项病理生理变化是单核细胞向血管内膜层移行、活化并刺激多种因子释放。已在体外证实,内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）能够作为单核细胞趋化剂使用,因此内皮素-1可能是动脉粥样硬化的一个始动因子：内皮素-1是体内最重要的内皮源性缩血管因子,体外实验证实,导致ET-1释放的原因较多,但主要认为与血管内皮受损有关。动脉粥样硬化因内皮受损引起ET-1升高,当其升高到一定程度时冠状动脉可发生痉挛,并进一步损伤内皮细胞使ET-1更加上升。ET-1也能够刺激血管平滑肌细胞的移行和增生,从而促进动脉粥样硬化的进程。ET-1通过强烈地收缩血管,促使平滑肌细胞增殖及血栓形成等机制导致和加速动脉粥样硬化、再狭窄。另外研究显示ET-1可通过刺激活性氧的产生加速AS的进程。因此ET-1可能通过以上途径参与了内皮细胞损伤及AS的形成。血红素氧合酶-一氧化碳-环磷酸鸟苷（HO-CO-cGMP）细胞信号系统,参与心血管系统的调节。血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）亦称为热休克蛋白32（hsp32）,是应激过程中体内出现浓度明显增加的一种应激蛋白,广泛分布在各种组织和细胞中。大量研究表明HO-1对氧化损伤所引起多种疾病具有保护作用,在正常血管平滑肌细胞和内皮细胞呈低水平表达,受到氧化应激刺激后高水平产生,能够抑制炎症反应的发生和保护血管内皮细胞,使其免于受到氧化应激的损伤。HO-1催化血红素降解的3个产物内源性一氧化碳（CO）、胆红素和铁蛋白是发挥细胞保护作用的关键分子。CO与一氧化氮（NO）对心血管系统有相似的作用,能激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）,升高细胞质中的cGMP水平,从而舒张血管平滑肌,抑制血小板聚集、平滑肌细胞增殖和炎性反应。HO-1/CO系统通过代偿和调节NOS/NO系统以及降低ET-1表达,改善内皮功能。虽然HO-1/CO系统的每个产物独自作用时都有保护作用,但是细胞保护作用主要是三者协同作用的结果。当应激发生时,适量诱导HO-1/CO系统的表达,能维护细胞自身稳定,实现对细胞的保护。氯化高铁血红素（Hemin）是体内HO-1的常用诱导剂。目的通过专用动物离心机模拟飞行实验高正加速度处理的新西兰白兔作为模型,取其主动脉内皮细胞进行培养,研究模拟飞行实验对兔主动脉内皮细胞相关细胞因子HO-1水平,CO含量,cGMP含量、ET-1含量、SOD活性、MDA含量指标的影响,然后利用HO-1诱导剂Hemin进行干预,探讨模拟飞行实验对主动脉内皮细胞损伤的影响及HO-1/CO系统对其的可能保护作用机制。方法所有新西兰白兔在相同条件下,自由饮水,摄食,保持自然光照,无不良因素影响,饲养一周适应实验室环境后开始进行实验。将16只清洁级、健康新西兰大白兔随机分为2组：空白对照组8只、模拟飞行实验处理组8只。本实验所采用的方法为离心机模拟飞行实验造模,离心机是在地面模拟飞行实验中持续加速度的专用设备,可以准确控制+Gz值、+Gz增长率和作用时间及模拟空战动作的+Gz模式。模拟飞行实验处理组：新西兰白兔放入动物离心机从+7Gz,45s开始离心,每天增加+0.5Gz,第11天增加到+12Gz,45s,第12天重复1次,第13天采用T型G模式检查+Gz耐力,增长率平均为+1Gz／s,每次增加+2Gz,暴露Gz值从12Gz开始,达到预定G值后恒速45s,然后下降,两次旋转之间休息5min,依次递增,直到耐受终点,即动物出现心跳减少到正常的一半。空白对照组：新西兰白兔放入动物离心机但不接受离心实验。在第13天后,各组新西兰白兔均按兔主动脉内皮细胞分离方法分离,应用原代细胞进行培养。将以上细胞分为三组,正常对照组（n=8）,动物实验中空白对照组主动脉内皮细胞在低血清（2%）细胞培养液中孵育12h；模拟飞行实验处理组（n=8）,动物实验中模拟飞行处理组主动脉内皮细胞在低血清（2%）细胞培养液中孵育12h；模拟飞行Hemin处理组（n=8）,动物实验中模拟飞行处理组主动脉内皮细胞在低血清（2%）细胞培养液中孵育30min后,再予Hemin（10umol/L）孵育12h。收集各组细胞及细胞悬液,观察以下指标变化,ELISA实验法检测细胞悬液ET-1含量,检测HO-1水平,CO含量,cGMP含量,同时分别检测细胞悬液MDA、SOD含量。实验所得所有数据应用SPSS13.0软件进行统计学描述与分析,计量资料用均数±标准差表示,采用两个样本的t检验进行统计学分析,以P<0.05为有显著性差异。结果1、模拟飞行实验处理组与正常对照组比较,主动脉内皮细胞悬液SOD活性显著降低（t=8.006,P<0.001）,其MDA含量显著升高（t=10.606,P<0.001）,以上的变化有显著性差异。Hemin处理飞行后的主动脉内皮细胞SOD活性显著升高于模拟飞行实验组比较具有统计学差异（t=7.263,P<0.001）; Hemin处理飞行后的主动脉内皮细胞MDA含量显著降低,与模拟飞行实验组比较具有统计学差异（t=6.211,P<0.001）。2、模拟飞行实验处理组与正常对照组比较,主动脉内皮细胞ET-1表达水平显著提高,有显著性差异（t=75.424,P<0.001）。Hemin处理飞行后的主动脉内皮细胞ET-1含量显著升高与模拟飞行实验组比较具有统计学差异（t=77.105,P<0.001）。3、模拟飞行实验处理组与正常对照组比较,主动脉内皮细胞HO-1表达水平显著提高,有显著性差异（t=32.441,P=<0.001）, CO含量显著提高（t=11.719,P=0.000）, cGMP含量显著提高（t=7.609,P=0.000）,以上的变化有显著性差异。Hemin处理飞行后的主动脉内皮细胞与模拟飞行实验处理组比较,主动脉内皮细胞HO-1表达水平显著提高,有显著性差异（t=49.632,P=<0.001）,CO含量显著提高（t=21.723,P<0.001）, cGMP含量显著提高（t=6.644,P<0.001）,以上的变化有显著性差异。结论1、模拟飞行实验的高正加速度处理可以影响主动脉内皮细胞氧化应激状态,加速细胞氧化损伤。2、模拟飞行实验的高正加速度能促进主动脉内皮细胞ET-1的释放,可能与主动脉内皮细胞受损有关。3、模拟飞行实验的高正加速度可促进主动脉细胞HO-1水平,CO含量,cGMP含量提高,说明HO-1/CO系统的高表达可能与机体在飞行应激时对主动脉内皮细胞的保护作用有关。4、Hemin处理模拟飞行实验后的主动脉内皮细胞,HO-1/CO系统内的HO-1水平,CO含量,cGMP含量释放显著增多,氧化应激得到改善,ET-1表达水平显著降低,说明Hemin刺激后细胞的HO-1/CO系统的高表达,可能为延缓机体在飞行应激时对主动脉内皮细胞的损伤提供一定的参考价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 中英方缩略词对照表
• 在读期间发表的论文
• 致谢
• 统计学审稿证明