论文摘要
大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属多年生草本植物,作为药食两用历史悠久。现代医学证明,大蒜主要具有抗感染、防治心脑血管疾病及抗肿瘤等三大功效。目前公认大蒜的功效成分是蒜酶（Alliinase,EC 4.4.1.4）催化裂解蒜氨酸（Alliin）产生的大蒜辣素（Allicin）、阿霍烯（Ajoene）等系列含硫有机化合物。由于大蒜有效成分的分离、提取或人工合成十分困难,蒜氨酸及大蒜辣素等单体的价格十分昂贵,而且大蒜辣素化学性质极不稳定,易分解,无法长期保存,目前的技术不可能直接制成药物制剂应用于临床,因此,本项目组陈坚教授在国内率先提出:从鲜蒜中分别提取化学性质相对稳定的蒜氨酸及蒜酶,然后科学组方,制成蒜氨酸/蒜酶复合制剂,让其在体内释放大蒜辣素、阿霍烯等有效成分,充分发挥疗效。本论文在前期研究工作的基础上,利用新疆优势大蒜资源主要完成以下研究内容:第一大蒜蒜酶提取纯化的实验室工艺研究。首先,建立了适用于提取中间体酶活力的测定方法。即采用丙酮酸法测定酶活力,考马斯亮兰G-250法测定蛋白质浓度,以此来计算比活力。然后,在大蒜蒜酶提取纯化的实验室工艺研究中依次完成:①确定粗酶浸提液的最佳组成为Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液（pH6.5）中含10%（V/V）甘油、20μmol/L PLP、1mmol/LCaCl2;②分别优选35%饱和度硫酸铵、15%（m/v）PEG8000沉淀酶蛋白;③引进超滤技术进一步纯化、浓缩酶蛋白;④确认蒜酶最佳调节等电点为4.9。在此基础上,分别采用硫酸铵沉淀法和PEG8000沉淀法提取纯化蒜酶各三批。利用实验室小试制得的蒜酶样品建立了HPLC法测定终产物蒜酶活力;采用SDS-PAGE法测定蒜酶分子量为108.0kDa。通过对大蒜蒜酶提取纯化的实验室工艺研究验证了实验目的的正确性、可行性,为大蒜蒜酶的中试生产研究积累数据、提供方法和经验。第二大蒜蒜酶中试生产工艺研究。利用中试生产设备和条件,进行工艺放大研究:①确定蒜瓣浸提打浆以料液比分别为1∶1和1∶0.5浸提两次;②随着浸提粗酶液浓度的改变,优选硫酸铵沉淀酶蛋白的饱和度为45%;③选用Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液（pH6.5）作为蛋白沉淀的重溶液。通过对大蒜蒜酶中试生产工艺条件的进一步优化,以大蒜蒜酶提取纯化的实验室工艺为基础,制定蒜酶中试生产工艺流程和标准操作规程,并采用硫酸铵沉淀法提取纯化大蒜蒜酶三批次,跟踪监测中试生产全过程,最终蒜酶中试产品的活力和收率均达到并超过了设计要求。SDS-PAGE法测定结果显示,蒜酶分子量为107.8kDa,与实验室工艺研究结果极为接近,首次实现了大蒜蒜酶由实验室小规模提取纯化向机械化、自动化程度较高的中试及大规模生产的过渡与转化。此外,利用中试生产的车间、设备和条件,采用PEG8000沉淀法制备粗酶,为后续研制大蒜蒜酶对照品提供纯度和活力均较高的蒜酶原料。第三大蒜蒜酶的酶学性质及其催化动力学特性研究。利用中试产品,在对大蒜蒜酶的酶学性质研究中,以天然蒜氨酸为底物,采用丙酮酸法测定蒜酶活力,结果发现,蒜酶具有热不稳定性和pH不稳定性;其酶解反应选择在35℃和pH7.00的缓冲体系中最佳;蒜酶溶解后,若放置较长时间,应选择在低温（≤5℃）和pH6.5的缓冲体系中为宜。临床常用溶剂中,含氯化钠的注射液（不含葡萄糖）对蒜酶活力有显著的激活作用,而含有葡萄糖的注射液则强烈抑制蒜酶活力。显然,临床应用时,含有葡萄糖的注射液不宜作为蒜酶的配伍溶液。75%和95%乙醇作为消毒液使用时也应避免其对蒜酶的杀伤作用。在对大蒜蒜酶/蒜氨酸催化动力学研究中,采用丙酮酸法测定蒜酶活力,考马斯亮兰染色法测定蛋白质浓度,以此计算蒜酶比活力。测得结果显示,大蒜蒜酶/蒜氨酸催化裂解反应的米氏常数Km=2.139mmol/L,最大反应速度Vmax=41.67 U/mg（蛋白）。第四大蒜蒜酶质量标准的建立。初步制定了大蒜蒜酶质量标准,项目包括性状、鉴别、检查、效价测定、类别和贮藏等几个方面,为大蒜蒜酶质量研究的进一步深入奠定基础。随着药物研发的不断深入,该质量标准还应不断修订和完善。