论文摘要
鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus,DHBV）与乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸（GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326）,具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法（间接法）;同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold,Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高（P＜0.01）,乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.01）,肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物（代号PNA）的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组（50mg/kg）基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。