论文摘要
儿童急性呼吸道感染（ARTI）是世界范围内小儿最常见的致病和致死原因之一,在过去几十年里,由于更先进仪器的应用及高灵敏性检测方法的建立,使得越来越多的呼吸道病毒被人们发现,人博卡病毒和人偏肺病毒即是近些年新发现的呼吸道病原,从而进一步丰富了呼吸道感染的病原普。本研究的主要内容及研究结果具体如下:1.根据人博卡病毒（Human Bocavirus,HBoV） NP-1基因和人偏肺病毒（Human Metapneumovirus,hMPV） M基因的保守序列设计用于常规PCR/RT-PCR的引物,扩增HBoV NP-1基因和hMPV M基因片段,建立HBoV和hMPV的常规PCR/RT-PCR检测方法,然后对反应条件进行优化并对检测方法的灵敏性和特异性进行评价。本研究所建立的常规PCR/RT-PCR检测方法检测HBoV NP-1基因和hMPV的M基因其灵敏度分别为250 DNA copies/reaction和500 DNA copies/reaction,且结果具有良好的特异性。2.根据HBoV和hMPV基因的保守序列设计用于实时荧光定量PCR/RT-PCR的引物和TaqMan探针。建立HBoV和hMPV的实时荧光定量PCR/RT-PCR（real-time Fluorescent Quantitative PCR/RT-PCR）检测方法并对建立的方法进行敏感性、特异性、重复稳定性实验。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法检测HBoV灵敏度为10 DNA copies/reaction;实时荧光定量RT-PCR方法检测hMPV灵敏度可达4.95 DNA copies/reaction,线性范围可达109-100 copies/reaction。且检测结果都具有良好的稳定性和可重复性,对临床其他常见呼吸道病毒检测未出现特异性扩增曲线,说明该检测方法的特异性良好。3.用所建立的方法对由沈阳儿童医院采集来的76份临床标本中的HBoV和hMPV进行平行检测,将两种检测方法的结果进行比较分析并探索其临床意义。用实时荧光定量PCR方法对76例临床标本进行检测,共检出HBoV阳性5例,高于常规PCR检测结果3例,且常规PCR检出结果包含在荧光定量PCR检出结果中;常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR方法对76份临床样本进行平行检测,检出hMPV阳性样本分别为（5/76）和（7/76）且常规RT-PCR检出结果包含在荧光定量RT-PCR检出结果中。说明两种检测方法有很好的符合率,相对于常规PCR/RT-PCR,荧光定量PCR/RT-PCR检测方法灵敏性、特异性更好。结论实验结果表明,本研究初步建立了针对儿童急性呼吸道感染的HBoV和hMPV的常规PCR/RT-PCR检测方法和实时荧光定量PCR/RT-PCR检测方法,并初步证明了所建立的方法具有灵敏、特异、快速的特点,将两种检测方法用于临床样本平行检测,结果显示两种检测方法具有较好的一致性,但实时荧光定量PCR/RT-PCR检测方法操作更简便、自动化程度更高、检测灵敏性更好、检测速度更快,可替代常规PCR/RT-PCR检测方法,具有在临床上应用的可行性及较好的应用前景。