肝癌转移复发预测标签的验证及重要分子的预测价值分析

论文摘要

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率逐年增长。最新数据显示,2008年,发病人数已超过74.83万/年,在男性中居于恶性肿瘤的第五位,女性中居第七位；死亡人数超过69.59万/年,在男性中位居肿瘤相关死亡的第二位,在女性中居第六位。我国肝癌发病人数和死亡人数均超过全球的一半。肝细胞肝癌（Hepatocellulaer Carcinoma, HCC）（简称肝癌）是原发性肝癌的主要病理类型,占到70%到85%。在发展中国家中,乙肝感染病人占到肝癌病人的60%,在发达国家也占到23%。肝癌的治疗以手术治疗最为有效,然而肝癌术后转移复发率高,肝癌根治性切除术后5年转移复发率为61.5%,即使小肝癌也达43.5%。因此解决术后患者的高转移复发率问题是提高肝癌疗效和获得长期存活的关键。若能对这些患者进行转移复发的预测,对可能转移复发的患者进行严密监测,及时给予干预治疗,做到早发现早治疗,就会进一步提高生存率,延长生存期,同时可以避免原本无需化疗的患者承受不必要的化疗毒副作用和经济负担。人们一直在努力探索可以预测转移复发的指标,传统意义的预测指标包括肿瘤大小和数目及血管侵犯等临床病理组织特征,但这些难以准确预测肿瘤病人的预后,事实上很多临床和病理因素相似的患者其预后却明显不同。分子标记物可提供更多常规临床病理特征以外的信息。作者所在课题组近年来应用高通量cDNA微阵列技术,从全基因组水平筛选出与肝癌转移复发相关的基因群,并建立了预测模型,然而这些基因的表达水平未经定量且数目较多,临床应用有难度,须进一步经实时定量PCR技术验证优化。本课题拟对前期cDNA微阵列筛选出的基因进一步验证优化,并对证实为较重要的预测基因进行蛋白水平和血清学的验证,以探讨其临床应用价值。第一部分实时定量PCR技术验证候选肝癌转移复发基因预测标签目的：应用精确定量技术验证候选肝癌转移复发基因预测标签。方法：按入选标准随机选择80例经根治性切除的肝癌病例,应用实时定量PCR技术（TaqMan（?）GB探针法）检测其癌组织及对应的癌旁组织中68个候选基因mRNA的表达水平,结合随访资料确定与肝癌转移复发和生存存在密切关系的基因。计数资料比较采用卡方或Fisher精确概率法；计量资料组间比较采用t检验；复发和生存情况的比较分析用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验。结果：在80例肝癌病人样本中,癌及对应的癌旁组织存在显著性表达差异的基因有46个。在癌组织中,表达量与总体生存（Overall survival, OS）相关的基因为RTP4 （P=0.005）、DDIT4 （P=0.015）、CMPK2 （P=0.050）,与至复发时间（Time to recurrence, TTR）相关的为RTP4 （P=0.016）、FLJ34 （P=0.018） GAK（P=0.020）;癌旁组织中,表达量与总生存相关的基因为PAR1 （P=0.001）、FRAT1 （P=0.030）、DDIT4 （P=0.043）,与复发相关的基因为DDIT4（P=0.003）、SNAI2 （P=0.003）、ADM （P=0.011）、PAR1 （P=0.018）。结论：在癌组织中,RTP4基因的mRNA表达同时与生存率和复发率均存在显著相关性,在癌旁组织中,PAR1及DDIT4基因的mRNA表达也与生存率和复发率均存在显著相关性,表明它们是具有潜在临床应用价值的预测标签。第二部分凝血酶受体的蛋白表达水平与肝癌术后转移复发及生存的关系目的：研究凝血酶的两种受体蛋白酶活化受体1（Protease-Activated Receptor 1, PAR1）和蛋白酶活化受体4（Protease-Activated Receptor 4, PAR4）在肝细胞肝癌癌组织和癌旁组织的蛋白表达水平,分析其与HCC患者预后的相关性。方法：第一部分已应用实时定量聚合酶链反应检测随机选择的80例经根治性切除的HCC早期患者癌组织及对应的癌旁组织中PAR1的mRNA表达水平,并分析其与肝癌预后的相关性。另随机选择153例HCC患者组织石蜡切片做免疫组织化学染色,分析PAR1及其家族中另一重要成员PAR4与HCC临床病理特征及预后的相关性。相关性分析采用卡方或Fisher精确概率法；计量资料比较用两组间比较的t检验或Wilcoxon符号秩检验；复发和生存情况的比较分析用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验。结果：免疫组织化学染色结果显示,PAR1主要表达于癌旁组织的间质细胞。PAR1在癌旁组织的蛋白表达水平与肿瘤分化相关（P=0.038）,PAR1阳性组患者平均生存时间为（58.39±4.59）个月,1、3、5年累计生存率分别为90.3%、83.9%和61.8%；PAR1阴性组患者平均生存时间为（75.84±1.87）个月,1、3、5年累计生存率分别为100.0%、100.0%和94.1%。患者平均至复发时间为（62.98±3.62）个月,PAR1阳性组患者至复发时间为（51.97±4.30）个月,1、3、5年累计复发率分别为10.2%、25.2%和40.6%；阴性组患者至复发时间为（71.92±3.77）个月,1、3、5年累计复发率分别为0、5.6%和21.3%。Kaplan-Meier分析显示癌旁PAR1的蛋白表达水平与病人的总生存时间（P=0.021）及至复发时间（P=0.030）存在相关性,蛋白阳性表达组病人1、3、5年的总生存时间和至复发时间明显低于阴性表达组。PAR4主要在癌旁肝组织中有阳性表达,多数表达在肝星状细胞。对病人的累积生存率做统计分析显示,PAR4高表达组病人1,3,5年累积生存率显著高于低表达组。PAR1和PAR4在癌组织中的蛋白表达水平与HCC复发和生存无明显相关性。结论：癌旁组织中PAR1和PAR4蛋白表达水平与HCC患者的预后密切相关,PAR1和PAR4可能参与了凝血酶介导的肝细胞肝癌的恶性侵袭行为,并可能成为判断预后的预测指标。第三部分血浆异常凝血酶原（DCP）浓度对肝癌术后转移复发及生存的预测价值目的：PARs主要表达于癌周肝组织的间质细胞上,在外周血中检测较难。PARs的配体凝血酶是由凝血酶原生成,在肝癌患者中除正常凝血酶原外还有异常凝血酶原（Abnormal prothrombin,APT）,即脱-γ-羧基凝血酶原（Des-gamma-carboxyprothrombin, DCP）。目前已发现它对肝癌的早期诊断有重要意义,我们分析了血浆DCP水平对肝癌转移复发和生存的预测价值。方法：随机选择78例经根治性切除的肝癌病例,应用ELISA方法检测其外周血血浆中DCP的浓度,结合随访资料分析其与肝癌转移复发和生存关系。相关性分析采用卡方或Fisher精确概率法；复发和生存情况的比较分析用Kaplan-Meier分析和Cox-Mantel log-rank检验。结果：血浆DCP浓度与肿瘤大小（P=0.002）、包膜（P=0.008）、肉眼癌栓（P=0.005）及术前血清AFP（P<0.001）均存在显著相关性。按照血浆异常凝血酶原浓度的中位数,将患者分为两组：高表达组和低表达组。Kaplan-Meier分析显示血浆DCP浓度与HCC复发（P=0.005）和生存（P=0.003）均有密切关系。结论：血浆DCP浓度与HCC根治术后肝癌的转移复发密切相关,是潜在的预测HCC转移复发血浆标志物.

论文目录

• 英文缩略语注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 实时定量PCR技术验证候选肝癌转移复发基因预测标签
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 凝血酶受体的蛋白表达水平与肝癌术后转移复发及生存的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 血浆异常凝血酶原（DCP）浓度对肝癌术后转移复发及生存的预测价值
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附件
• 致谢