论文摘要
目的：构建GST-p33ING1b的原核融合蛋白表达载体，实现融合蛋白在工程菌中的高效表达，并建立融合蛋白的高效纯化方法，使GST-p33ING1b融合蛋白得以在实验室条件下高效表达和纯化。方法：利用PCR技术扩增p33ING1b的全长开放读码框（open reading frame，ORF），将其插入pBS-T载体扩增并进一步亚克隆至原核融合蛋白表达载体pGEX-5X-3，构建成原核融合蛋白表达质粒pGEX-5X-3-p33ING1b。经DNA测序证实插入序列和读码框的正确性后，转化至工程菌BL21中，经IPTG诱导GST-p33ING1b融合蛋白的表达。超声裂解工程菌体，收集包涵体，尿素溶解，透析复性，谷胱甘肽琼脂糖（glutathione sepharose 4B）球珠亲和纯化，经免疫印渍证实表达蛋白的免疫原性。结果：经PCR扩增得到p33ING1b全长ORF，酶切和DNA测序证实所构建原核融合蛋白表达载体pGEX-5X-3-p33ING1b插入序列、读码框均完全正确，插入片段全长837bps，所编码融合蛋白GST-p33ING1b读码框全长理论分子量60kDa。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示：（1）pGEX-5X-3-p33ING1b转化的BL21工程菌在接受IPTG诱导后，在60 kDa位置出现一新蛋白条带，其分子量与GST-p33ING1b融合蛋白的理论分子量相符；（2）经包涵体变性、复性处理和亲合层析后，新蛋白条带可被glutathione sepharose 4B球珠纯化。免疫印渍证实纯化产物具有GST的免疫原性。结论：（1）成功构建了pGEX-5X-3-p33ING1b的原核融合蛋白表达载体；（2）GST-p33ING1b融合蛋白可在BL21工程菌中大量表达，并以包涵体形式存在于细胞胞浆；（3）通过包涵体收集、尿素变性及复性过程，GST-p33ING1b融合蛋白可经glutathione sepharose 4B球珠高效纯化。
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标签：原核融合蛋白表达系统论文; 亲和层析论文; 包涵体论文;