RPS14基因过表达对人MDS细胞株MUTZ-8增殖的影响

论文摘要

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是累及造血干细胞的异质性克隆性疾病，以无效造血及高风险向急性白血病转化为特征。目前本病预后差，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，对改善MDS的预后具有重要意义。5号染色体长臂缺失是MDS普遍存在的染色体异常之一，研究发现缺失的区域均包括5q31-5q32，该区域称为共缺失区域（common deleted region，CDR）。RPS14（ribosomal protein S14, RPS14）基因位于该区域，表达量明显下降。我们的前期研究已经表明，伴de（l5q-）MDS患者体内RPS14基因表达水平下降，RPS14在MDS的发病发展中起着很重要的作用。本实验通过构建携带人RPS14基因的重组慢病毒载体pGC-FURPS14-GFP，并将构建成功的重组慢病毒载体感染人MDS细胞株MUTZ-8细胞，增高目的基因在靶细胞内的表达水平，再通过细胞毒力实验、凋亡率的变化来观察RPS14表达水平增高后对MUTZ-8细胞增殖、凋亡的影响。方法：1、携带人RPS14基因的重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP的构建及鉴定：选用慢病毒pGC-FU-EGFP为载体，首先设计合成RPS14PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP，逐孔稀释法测定病毒滴度；采用流式细胞仪检测感染效率，RT-PCR及Westernblot检测感染前后目的细胞内RPS14mRNA及RPS14蛋白的表达变化。2、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8细胞后对其增殖影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组（MUTZ-8）、空病毒感染组、感染组，应用噻唑蓝（MTT）法测定各组细胞的OD值，绘制生长曲线。3、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8细胞后对其凋亡影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组（MUTZ-8）、空病毒感染组、感染组，应用流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率。结果：1、本实验成功构建了重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP，滴度达2.0×109Tu/ml，构建的慢病毒载体能够高效率的感染MUTZ-8细胞，100MOI的重组慢病毒载体对MUTZ-8细胞的感染效率约为（51.303±3.908）%，RT-PCR、Western blot检测均显示感染后目的细胞RPS14mRNA及蛋白的表达水平高于感染前。2、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8细胞后抑制其增殖：感染后2d、3d、4d、5d，收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的吸光度值，感染重组慢病毒载体后对MUTZ-8细胞的生长有抑制作用，与空病毒感染组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。3、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染MUTZ-8细胞后促进其凋亡：流式细胞术检测感染前后细胞的凋亡率变化，感染重组慢病毒载体后MUTZ-8细胞凋亡率为（26.233±3.095）%，显著高于空病毒感染组细胞的凋亡率（P＜0.05）。结论：1、慢病毒载体可以高效率感染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗研究具有重要的临床应用价值；2、RPS14基因表达水平增高抑制人MDS细胞株MUTZ-8细胞的增殖；3、RPS14基因表达水平增高促进人MDS细胞株MUTZ-8细胞的凋亡；4、RPS14基因在MDS的发生发展中起着很重要的作用，本研究为进一步将RPS14作用MDS的分子靶标研究提供了实验数据。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 携带人 RPS14 基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 RPS14 基因过表达对人 MDS 细胞株 MUTZ-8 增殖影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述 骨髓增生异常综合征的分子生物学研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文