玉米麦根酸代谢评价体系的建立及缺铁胁迫相关代谢基因片段的克隆

论文摘要

缺铁是世界农业生产中非常普遍的一个产量限制因子,在干旱半干旱的石灰性土壤上,果树、玉米、高粱等作物的缺铁问题尤为严重。解决这一问题有两条途径:一是通过改良土壤营养状况,改变或排除土壤障碍因子以适应植物生长发育,如施肥、添加土壤改良剂和其他技术措施等。二是通过育种手段,改良植物的矿质营养遗传特性,使其活化被土壤吸附固定的养分,变固定态为可利用态,从而被植物吸收利用,即挖掘植物和土壤本身固有的潜力充分利用自然资源。培育铁营养高效新品种是减轻缺铁影响的有效方法,是当前的研究热点之一。禾本科类植物能够由根系分泌麦根酸类物质（Mugineic acids,简称MAs）,也叫植物铁载体（Phytosiderophores,简称PS）来活化土壤中难以被植物吸收利用的铁,使之易于被植物吸收利用,从而解决自身铁营养缺乏的问题。本研究以玉米自交系为材料,对三种玉米麦根酸类物质的测定方法进行比较,同时分析了不同玉米自交系苗期麦根酸类物质的分泌能力和缺铁敏感性,比较了不同生育时期玉米麦根酸分泌能力的差异,研究了玉米麦根酸分泌特性的遗传规律,建立了玉米苗期缺铁胁迫诱导的cDNA文库,并对该cDNA文库的近1000个克隆进行了测序分析。主要研究结果如下:1筛选建立了玉米麦根酸类物质测定方法以16种玉米自交系为材料,根据麦根酸类物质的溶铁特性,建立了麦根酸类物质间接测定新方法——ICP-AES法,改良了脱氧麦根酸（DMA）的UV-HPLC直接测定法,并与传统的比色法测定结果进行比较。结果表明,采用ICP-AES法,以Fe2O3粉末作为活化对象,与传统采用Fe（OH）3的测定结果相比,结果稳定、重复性好,说明ICP-AES法是玉米麦根酸类物质分泌量的一种简单、快速的间接测定方法。改良的UV-HPLC法也具有准确、高效的特点,可应用于禾谷类作物DMA分泌量的直接测定。高效液相色谱法是PS测定的准确方法,但在材料选择时可以利用ICP-AES方法来对材料的麦根酸分泌能力进行测定。2建立了玉米自交系麦根酸分泌特性的评价体系以46种玉米自交系为材料,利用高效液相色谱法和等离子体法测定了苗期和穗花期缺铁胁迫前后玉米根系的麦根酸分泌速率,评价了不同材料的麦根酸分泌能力、缺铁敏感性和不同生育时期分泌量的变化。结果得出,在苗期缺铁胁迫前后材料的PS分泌能力之间存在着显著相关关系同时两种测定方法之间存在显著相关关系r （Fe+） = 0.7149**;麦根酸分泌特性在不同发育时期存在较大差异,四叶一心期和穗花期的测定结果具有显著的相关性r=0.9701*,穗花期玉米PS分泌速率的下降程度与苗期玉米PS分泌速率之间具有显著的对数相关关系r=0.892*;利用苗期材料的麦根酸分泌能力和缺铁敏感性建立了麦根酸分泌特性的评价体系,以缺铁胁迫前PS分泌速率的平均数[2.836 mg/（g*per plant*3h）]和缺铁胁迫后的PS分泌速率增加量的平均数[0.209 mg/（g*per plant*3h）]作为分界线可以将材料分为具有不同PS分泌能力和缺铁敏感性的四种类型:HH,HL,LH,LL,其中具有LH型低PS分泌速率和高缺铁胁迫敏感性的材料是铁营养高效育种的理想材料。3分析了玉米麦根酸代谢遗传规律选用八个具有不同MAs分泌能力的玉米自交系,采用半双列杂交的试验设计,分析了杂交后代的麦根酸分泌能力,结果表明亲本麦根酸分泌特性的测定结果与材料自身GCA的相关系数均达到极显著水平,SCA效应值最高的组合并不一定是麦根酸分泌能力最高的组合,只有组合的SCA和双亲的GCA效应均高,才有可能获得麦根酸分泌能力较高的组合,组合的表现与其TCA效应一致。玉米麦根酸类物质的分泌特性以显性效应占优势,遗传加性效应相对较小,麦根酸分泌能力的遗传模型经检验证明符合加性-显性模型,而其缺铁敏感性的遗传模型则不符合。控制麦根酸分泌能力表现显性的主效基因组不少于一组,显性方向为减效;控制麦根酸缺铁敏感性表现显性的主效基因组数较少,显性方向为增效,二者的主效基因组可能不相同。4建立了缺铁胁迫诱导的抑制性扣除杂交cDNA文库以缺铁胁迫前的昌7-2根尖cDNA为driver cDNA,缺铁胁迫后的昌7-2根尖cDNA为Tester cDNA;以缺铁胁迫后的昌7-2根尖cDNA为driver cDNA,缺铁胁迫后的郑58根尖cDNA为Tester cDNA,进行两组抑制性扣除杂交,获得了与玉米缺铁胁迫代谢和麦根酸代谢能力差异表达有关的cDNA PCR产物,建立了相关文库。5分析了玉米缺铁诱导代谢的相关基因分析已获得的与玉米缺铁胁迫特异性表达的抑制性扣除杂交的PCR产物建立的SSH文库,其包含的片段大小为200bp-900bp。从文库中挑取了1230个克隆进行测序,除去8%的冗余片段共得到非重复的序列203个,其中77个的Blast结果表明它们可能是新发现的序列,除此之外其中:9个片段（0002,0034,0039,0143,0152, 0214, 0355,0375, 1152）可能与缺铁胁迫后植物适应代谢能量降低的调控有关;3个片段（0183,0232,0350）可能与细胞质膜上铁的还原酶有关;2个片段（0061,0622）可能与植物体内或细胞膜上铁离子的结合蛋白有关;5个片段（0094,0155,0208, 0249, 0985,1055）可能与细胞质膜的转运功能有关,3个片段（0234,0362,0387）与氨基酸的转运功能有关,5个片段（0103,0116,0274, 0382,0681）与植物的抗逆性有关,2个片段（0201,1183）与转录调控有关。同时在所有得到片段中, 0257与DNA的促旋酶有关。可能与遗传规律的减效显性作用有关。其余部分片段可能为未知功能片段。这些基因的差异表达与玉米缺铁胁迫的基因调控的关系有待进一步阐明和分析。

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第一章文献综述

1.1 铁在土壤中的存在形态和有效性

1.2 铁对植物的生理作用

1.2.1 铁参与光合作用和叶绿素的合成

1.2.2 铁参与体内氧化还原反应和电子传递

1.3 植物根系在适应缺铁方面的机理

1.3.1 机理Ⅰ型植物

1.3.2 机理Ⅱ型植物

1.4 与植物铁营养效率相关的基因

1.4.1 机理Ⅰ植物中与铁营养效率相关的基因

1.4.2 机理Ⅱ植物中与铁营养效率相关的基因

1.5 抑制性扣除杂交在植物中的应用

1.5.1 抑制性扣除杂交的原理

1.5.2 抑制性扣除杂交在植物抗性基因克隆中的应用

1.6 根系分泌物的研究意义及发展前景

1.6.1 充分挖掘植物和土壤本身固有的潜力，充分利用自然资源

1.6.2 降低农业生产成本，提高作物产量，增加农民收入

1.6.3 改善作物品质，改良人们的营养状况

1.6.4 减少无机肥料的使用量，降低无机肥料对环境造成的污染

第二章玉米麦根酸测定方法研究

2.1 材料与设备

2.1.1 材料

2.1.2 设备

2.2 方法

2.2.1 玉米水培及根系分泌物的收集方法

2.2.2 分光光度计法

2.2.3 ICP-AES 法

2.2.4 HPLC 法

2.2.5 试剂的配制

2.2.6 数据处理

2.3 结果与分析

2.3.1 测定方法的建立

2.3.2 不同测定方法稳定性及结果间差异比较

2.3.3 ICP-AES 法测定结果与UV-HPLC 间相关比较

2.4 小结

第三章玉米自交系麦根酸分泌特性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验仪器

3.1.3 试验方法

3.1.4 测定方法

3.2 结果与分析

3.2.1 玉米麦根酸分泌能力测定方法比较

3.2.2 玉米PS 分泌特性分析

3.3 小结

第四章玉米麦根酸分泌特性遗传分析

4.1 材料与方法

4.1.1 供试材料与材料水生培养

4.1.2 双列杂交材料水生培养

4.1.3 麦根酸分泌量测定方法

4.2 统计方法

4.3 结果与分析

4.3.1 方差分析

4.3.2 玉米缺铁敏感性及麦根酸分泌能力的配合力分析

4.3.3 玉米PS 分泌特性的遗传参数分析

4.4 小结

第五章玉米苗期缺铁胁迫诱导MAs 代谢相关基因的克隆

5.1 材料与方法

5.1.1 试验材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 试验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 玉米根尖总RNA 质量检测

5.2.2 连接效率分析

5.2.3 消减杂交结果

5.3 小结

第六章玉米缺铁胁迫条件下相关代谢基因的分析

6.1 材料与方法

6.1.1 材料与设备

6.1.2 实验方法

6.2 结果与分析

6.2.1 SSH 文库的构建

6.2.2 重组克隆的序列分析

6.3 小结

第七章讨论与结论

7.1 讨论

7.1.1 测定方法的选择

7.1.2 玉米PS 分泌能力测定时期

7.1.3 麦根酸分泌特性评价体系的建立

7.1.4 玉米麦根酸类物质分泌特性的遗传规律

7.1.5 玉米缺铁代谢相关基因的分析

7.2 结论

7.2.1 建立了麦根酸类物质的快速测定方法

7.2.2 建立了玉米麦根酸类物质的评价体系

7.2.3 玉米麦根酸分泌特性遗传规律分析

7.2.4 建立了缺铁胁迫诱导的抑制性扣除杂交cDNA 文库

7.2.5 分析了玉米缺铁代谢的相关基因

参考文献

附录

附表

致谢

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