论文摘要
瘤胃微生物蛋白质是反刍动物小肠氨基酸（AA）的重要组分。微生物的任何变化,如微生物的区系、AA-N比例、AA组成等的变化都将影响十二指肠AA的供给。在过去的研究和生产中一直认为瘤胃微生物AA是恒定的。然而1992年Clark等综合比较众多研究者的研究结果提出了瘤胃微生物AA是可变化的观点,此后至今,由于其对宿主不可或缺的重要性而使得微生物AA变化与否的论题一直为本领域研究与争论的焦点。为此,本课题结合in vitro与in vivo法,并引入荧光标记细菌技术以及SSCP、克隆测序等分子生物学技术,系统地探讨微生物蛋白质AA的变化规律及其机制,试验共分九个部分进行。试验1荧光标记瘤胃细菌方法的建立和原虫吞噬细菌速率的研究以4只装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊提供的瘤胃液制备荧光标记瘤胃细菌,用于瘤胃原虫的摄食实验,研究山羊瘤胃原虫吞噬细菌的速率。试验设置清洗原虫祛除瘤胃自由细菌的荧光全标组（WFLB）及未清洗原虫保留瘤胃自由细菌的荧光标记组（FLB）。结果表明: WFLB组、FLB组吞噬速率分别为:398.40 cells/（cell h）、230.40 cells/（cell h）,换算为细菌N为:2.15 pg N/（cell h）、1.24 pg N/（cell h）;每天每头山羊瘤胃内蛋白微循环中细菌N循环量WFLB组、FLB组分别估计为:103.20 mg N/（d头）、59.50 mg N/（d头）,或者细菌蛋白循环量分别为0.645 g/（d头）和0.372 g/（d头）;结果同时表明,荧光标记技术可以应用于瘤胃原虫对细菌吞噬速率的研究。试验2日粮精粗比对山羊瘤胃内微生物蛋白质微循环影响的研究本试验以4只装有瘤胃瘘管的山羊,研究不同精粗比日粮对山羊瘤胃微生态中原虫和细菌区系以及微生物蛋白微循环的影响规律。试验设置精（玉米-豆粕）:粗（稻草）分别为10:90、30:70、50:50、70:30的四种比例日粮（A、B、C、D）,采用4×4拉丁方设计进行动物试验,并结合荧光标记瘤胃细菌技术测定瘤胃原虫对细菌的吞噬速率。结果表明:日粮精粗比显著影响微生物细胞的密度。原虫的密度以C组最高;细菌和原虫的密度以都A组最低。日粮精粗比也显著影响原虫吞噬的速率,A、B、C、D四组吞噬速率分别为:429.50 cells/（cell h）、366.74 cells/（cell h）、389.48 cells/（cell h）、402.20 cells/（cell h）,换算为对细菌N的吞噬速率分别为:2.319 pg N/（cell h）、1.98 pg N/（cell h）、2.103 pg N/（cell h）、2.172 pg N/（cell h）。每天每头山羊由于原虫的吞噬造成的细菌N的循环量分别估算为:136.49 mg N/（d头）;369.02 mg N/（d头）;485.99 mg N/（d头）;440.56 mg N/（d头）,或者菌体蛋白循环量为0.853 g Pr/（d头）、2.306 g Pr/（d头）、3.370 g Pr/（d头）和2.754 g Pr/（d头）,以C组菌体蛋白循环量最大,细菌周转率最高（3.07 %）。试验3精粗比对瘤胃发酵、原虫种群结构及吞噬速率的影响在试验2的基础上,进一步研究在不同精粗比例配合日粮条件下山羊瘤胃发酵、原虫种群结构以及吞噬速率的变化规律。结果表明:日粮精粗比对瘤胃发酵有影响。以30:70组微生物活力较强、NDF降解率较高、瘤胃pH值也相对波动较小;精粗比对瘤胃原虫结构也有影响。50:50、70:30日粮组内毛虫和等毛虫的比例显著高于10:90、30:70组;而双毛虫和头毛虫则相反。内毛虫与双毛虫和头毛虫的吞噬速率分别为361.90、606.30和607.50 cells/（cell h）,内毛虫的吞噬速率显著低于双毛虫和头毛虫（P =0.000）,表明不同种属原虫吞噬细菌速率间有显著差异,但随日粮精粗比变化的规律基本一致。回归分析表明吞噬速率与日粮结构间呈三次方的曲线关系（Y=-724.53X+563.15X2-124.666X3+646.833,R2=0.97864）。另外,多元回归分析表明吞噬速率与微生物细胞密度有线性关系（R2=0.839）。方程为:Y=445.514-3.078X1+1.864X2（Y为吞噬速率;X1为细菌密度;X2为原虫密度）。试验4碳水化合物结构对瘤胃发酵和微生物群体结构的影响以3只瘘管山羊作为瘤胃液供体,用体外法研究底物碳水化合物结构对瘤胃发酵及微生物群体特征的影响。底物可溶性淀粉/纤维素比例为:100:0、70:30、50:50、30:70、0:100。结果表明:30:70组微生物产量和纤维降解率最高,发酵状态最佳;微生物蛋白产量与淀粉/纤维有三次方的曲线关系,细菌蛋白:Y=0.2410+0.0855X-0.0371X2+0.0029X（3R= 0.7397）;原虫蛋白:Y=0.2276+0.0853X-0.0380X2+0.0030X3（R=0.7370）。各组分别在8、16、24、24和24 h出现最大微生物产量（P<0.01）。另外,微生物AA-N比例在各组间也有显著差异（P<0.05）。微生物区系原虫与细菌的比例总体上随淀粉水平下降呈先上升后降低,以50:50组最高;而且PCR-SSCP图谱反映了区系内部类群因底物的改变而改变。原虫分类计数结果表明随淀粉水平的下降,内毛虫与等毛虫的比例下降,而双毛属与头毛亚科原虫的比例增加,与SSCP的结果一致地表明其内部类群的改变。对提取DNA的质、量的检测表明:微生物分离平均获得率为53.29 %;细菌DNA的提取率（45.40 %）显著低于原虫（56.10 %）（P<0.05）;微生物分离后DNA提取率为26.13 %;所提取的基因组DNA大小在20 kb以上,适合于后续研究的分子操作。综合以上试验结果可认为底物的变化引起了微生物发酵和其群系特征的变化,结果还证实PCR-SSCP适合于瘤胃微生物混合群体多样性研究,同时也验证了ITS1区段是研究瘤胃原虫的良好素材,从而基本确立了本课题瘤胃微生物群体研究的方法体系。试验5不同分子形式氮源对瘤胃微生物蛋白产量和类群多样性的影响本试验的主要目的是研究不同分子形式氮源在人工瘤胃体外培养条件下对瘤胃发酵、微生物蛋白合成和类群多样性的影响。以3只瘘管山羊为瘤胃液供体,底物设计为:氯化铵、寡肽混合物（<3, 000 Da）、小肽混合物（<500 Da）、游离氨基酸混合物。结果表明:pH在6.40-6.90之间变化,游离氨基酸组pH均值最低为6.61,氯化铵组的最高为6.79;氨氮浓度变化范围为11.60-29.45 mg/100 ml,均值以寡肽组最低为15.70 mg/100ml,游离氨基酸组最高为19.15 mg/100 ml;氯化铵组的细菌与原虫蛋白产量皆最低（0.1522、0.1179 mg/ml）（P<0.01）,而两肽组的微生物蛋白产量则相对较高;另外原虫与细菌比值以氯化铵组最低为77.49 %,小肽组最高为104.50 %（P<0.01）。同时AA-N比例在各组间也有显著差异,以游离氨基酸组最低（P<0.05）。SSCP指纹图谱表明微生物类群内部种属也发生了变化,并以氯化铵组微生物的多样度最低。以上研究结果揭示了氮源的分子形式显著影响瘤胃发酵、微生物蛋白合成和微生物的类群结构。试验6特定AA缺省对体外培养瘤胃微生物生长限制性的研究本试验采用底物移除法研究特定氨基酸在人工瘤胃体外培养条件下对瘤胃微生物生长及其发酵特征的影响。以3只瘘管山羊作为瘤胃液供体,底物为:全量必需氨基酸组（A）,组氨酸（B）、赖氨酸（C）、蛋氨酸（D）和支链氨基酸（E）的缺省组。结果表明:培养液pH值在5.90-6.80之间变化,均值以E组最高为6.54;培养液氨氮浓度变动范围为10.99-30.51 mg/100ml,均值以A组最高为17.85 mg/100 ml;底物对微生物生长的限制程度不同。以支链氨基酸缺省对微生物蛋白合成的限制最大,其细菌与原虫及其微生物蛋白的产量皆最低（0.1389、0.1772和0.3161 mg/ml）（P<0.01）,相对于A组微生物蛋白下降了44.52 %。底物对细菌和原虫影响不同。原虫与细菌比值以C组最低（89.12 %）,E组最高（127.60 %）（P<0.01）。同时底物还引起了微生物AA-N比例的变化（P<0.01）,以A组最低（16.89）,E组最高（18.76）。另外遗传指纹分析提示微生物区系内部类群也因底物而发生了变化。综合以上试验结果可认为特定氨基酸对微生物生长及微生物发酵都有一定的影响。试验7蛋白质补充料对体外培养瘤胃微生物区系和发酵的影响本试验以不同蛋白质补充料为底物进行体外培养,主要探讨蛋白质补充料对瘤胃微生物发酵和区系特征的影响。试验采用3只瘘管山羊作为瘤胃液供体,底物为:A（羽毛粉）、B（玉米蛋白粉）、C（豆粕）和D（鱼粉）。结果表明:pH值在5.80-6.80之间变化,均值以C组最低为6.19,A组最高为6.61;氨氮浓度变动范围为3.68-12.01 mg/100ml,均值以A组最低为5.49 mg/100ml,C组最高为9.95 mg/100ml;微生物蛋白产量在各组间差异显著或极显著（P<0.05、P<0.01）,以D组最高（0.6513 mg/ml）,A组最低（0.5289 mg/ml）,C组细菌蛋白量（0.3309 mg/ml）为四组之最高。底物对微生物区系有选择作用。原虫与细菌比值以A组最高（107.00 %）,C组最低（84.30 %）。SSCP图谱分析表明微生物区系内的类群结构也因底物发生了改变。另外底物还引起了微生物AA-N比例的变化,以D组最高（17.75）,C组最低（16.48）（P<0.01）。综合以上试验结果认为不同蛋白质补充料体外培养条件下其瘤胃微生物发酵和微生物区系特征有明显不同。试验8、9混合日粮蛋白质对徐淮山羊瘤胃微生物结构及AA组成的影响试验8以4只瘘管山羊作为试验动物,采用4×4拉丁方设计进行试验。研究由羽毛粉（A）、玉米蛋白粉（B）、豆粕（C）和鱼粉（D）等不同蛋白质饲料配合的混合日粮对瘤胃发酵、微生物群体结构、微生物蛋白（MCP）产量及其AA组成模式的影响规律。在第一期正试期开始时分别从四只羊瘤胃中采集瘤胃液,用于相应日粮作为培养底物的预先体外培养试验,以确保复杂与昂贵的体内试验的有效性和必要性。结果表明,由不同蛋白补充料所配制混合饲料底物对瘤胃发酵、微生物类群结构及AA-N影响与单纯的蛋白补充料相比,在底物样本间差异程度上虽然有所降低,但影响规律影响基本一致,并且微生物类群结构及AA-N仍有明显或显著变化,表明进一步开展体内试验是必要和有意义的。试验9继而开展的104天的4×4拉丁方体内试验结果表明:瘤胃液pH值在5.60-6.80之间变化,均值以A和C组较高,B和D组较低（P<0.05）,A和C、B和D的pH均值虽相近,但随时间的动态变化模式相差较大;氨氮浓度变动范围为6.77-21.67 mg/100ml,均值以A组最低为11.08 mg/100ml,C组最高为15.04 mg/100ml,各组随时间动态变化模式也有所不同;日粮蛋白显著影响MCP产量,以C、D组微生物蛋白较高,A、B组较低（P<0.05）;虽然C、D组微生物蛋白相当,但C组细菌蛋白产量却显著高于D组（P<0.05）。原虫与细菌区系比例在组间差异显著,豆粕组（81.27 %）显著低于其他三组（P<0.05）。进一步克隆测序分析表明细菌中的类R.flavefaciens、R.bromii、Roseburia faecalis等8群系在组间差异显著;原虫中除Diplodinium外其他4类群都有显著差异。微生物的AA-N比例在各组间也有显著差异,并以C组最低,D组最高,并且与细菌（原虫）蛋白质呈负（正）相关关系。研究同时发现部分种类AA含量在微生物区系间和同一区系内不同组间差异显著。原虫蛋白的Val比例高于细菌,而细菌蛋白的Lys则高于原虫。细菌蛋白的Arg;原虫蛋白的Met、Leu和His在各组间差异显著。差异性AA的变化与微生物类群的变化有一定的关联。综上可见混合日粮蛋白质对瘤胃发酵、微生物类群结构和微生物AA组成都有一定的影响。
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