红花檵木的AFLP与SRAP分析及分类研究

论文摘要

红花檵木（Loropetalum chinense var.rubrum）又名红桎木,红檵木,为金缕梅科檵木属檵木的变种,常绿灌木或小乔木,是湖南特有资源。目前主要依靠外部形态特征来进行红花檵木资源的评价、分类和菌木品种的鉴别,而外部形态特征受环境因子的影响比较大,不太稳定。因此,在红花檵木苗木市场上难免会出现同名异物,同物异名现象。这不但给红花檵木的生产带来很大的损失,也严重影响了红花檵木种质资源的合理利用及新品种的选育和推广。分子标记以DNA为直接检测对象,可以在很大范围内对高等生物的遗传物质进行较全面而细致的比较。本研究采用AFLP技术和SRAP技术对22份红花檵木变异材料以及檵木、长红檵木、黄檵木各一份为对照,共25份材料,进行了遗传多样性、分类及亲缘关系研究,旨在为红花檵木资源的评价、分类提供更加科学有效和实用的方法,在DNA分子水平上鉴定和检测其苗木真实性和纯度,为保护红花檵木育种产权、登录新品种、仲裁苗木纠纷,规范苗木市场等提供客观、科学和准确的技术保障。同时比较AFLP分析、SRAP分析与联合数据分析在红花檵木分类中的异同之处。获得的主要研究结果如下:（1）建立了获得高纯度适合SRAP和AFLP标记的红花檵木基因组DNA模板制备技术体系。本试验以红花檵木的嫩叶、成熟叶、果实为材料用CTAB+Tris-HCl洗涤法、CTAB法、SDS+Tris-HCl洗涤法、SDS法均获得了HMW基因组DNA,其中嫩叶提取的DNA纯度高但浓度底,但嫩叶取材不方便,用CTAB+Tris-HCl洗涤法提取成熟叶片的DNA纯度和浓度都有保障。（2）试验得出的红花檵木基因组SRAP-PCR体系的优化体系为50μL,含:Mg2+1.6 mmol/L、dNTPs 1.0 mmol/L、模板150 ng、TaqDNA聚合酶3.6 U、上游下游引物各0.20μmol/L。扩增程序为:在94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃1 min,35℃1 min,72℃1 min条件下运行;随后的30个循环复性温度提高到55℃,最后72℃延伸5 min。（3）本研究用8对AFLP引物,对25份材料进行分析,获得清晰的DNA指纹图谱,8对引物共扩增出1226条带,其中多态性带为1085,多态性比率88.5%,说明红花檵木遗传多样性丰富。25份材料之间的遗传相似范围在0.6819～0.8975之间,平均值为0.7390。玫红长叶青栽培种与玫红长叶青野生种遗传相似系数为0.8975,亲缘关系最近;密枝亮红与玫红长叶青遗传相似系数为0.6819,亲缘关系最远。用Ntsys2.10软件进行UPGMA聚类分析,主成份PCA分析,获得聚类树形图和分布图。以0.68为阈值可以将25份品种划分为以2个类群;以0.74为阈值可划分为5个类群;以相似系数0.758为阈值,可划分为8个类群。表明红花檵木资源的多样性与复杂性。（4）本研究用12对SRAP引物,对25份材料进行SRAP分析,获得清晰的DNA指纹图谱,12对引物共扩增出165条带,多态性带为145条,多态性比率88.48%。说明红花檵木遗传多样性丰富。25份材料之间的遗传相似范围在0.5714～0.8927之间,平均值为0.7549。密枝亮红与大圆叶双面红遗传相似系数为0.8927,亲缘关系最近。大叶卷瓣红花叶类型与玫红细叶青栽培种相似系数为0.5714,亲缘关系最远。用Ntsys2.10软件进行UPGMA聚类分析,主成份PCA分析,获得聚类树形图和分布图。以0.7253为阈值可将25份品种划分为6个类群;以0.7565的处相似系数为阈值,可将25份红花檵木划分为8个类群（5）将AFLP与SRAP原始数据联合,用Ntsys2.10软件进行UPGMA聚类分析,主成份PCA分析,获得联合数据的聚类树形图和分布图。以0.7490的处相似系数为阈值,可将25份红花檵木划分为7个类群。（6）利用联合数据对檵木属的变种材料进行了分析,得到各变种与原种之间的亲缘关系和进化数树,檵木变种间的亲缘关系为:黄檵木与檵木亲缘关系最近,其次是长红檵木,红花檵木最远。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 红花檵木研究进展
• 1.1 红花檵木分类研究
• 1.1.1 形态学分类
• 1.1.2 分子标记分类
• 1.2 红花檵木品种选育研究
• 1.3 红花檵木野生资源调查研究
• 1.4 红花檵木生物学、细胞学研究
• 1.4.1 红花檵木生态习性
• 1.4.2 红花檵木叶色、花色研究
• 1.5 红花檵木栽培管理、繁殖与园林应用
• 1.5.1 栽培技术
• 1.5.2 扦插繁殖
• 1.5.3 组织培养
• 1.5.4 红花檵木桩景制作
• 1.5.5 园林应用
• 2 AFLP标记及其在观赏植物上的应用
• 2.1 AFLP标记技术原理
• 2.2 AFLP标记技术在观赏植物中的应用
• 2.2.1 遗传多样性和分类研究
• 2.2.2 种质鉴定
• 2.2.3 系谱分析
• 2.2.4 基因的定位和克隆
• 2.2.5 数量性状基因定位（QTL）
• 3 SRAP分子标记技术与应用
• 3.1 SRAP技术原理
• 3.2 SRAP在植物研究中的应用
• 3.2.1 遗传图谱构建
• 3.2.2 遗传多样性分析与种质鉴定
• 3.2.3 比较基因组学
• 3.2.4 标定基因
• 4 研究目的意义
• 第二章 红花檵木DNA模板制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 实验材料处理
• 2.2 DNA提取
• 2.2.1 CTAB+Tris-HCl洗涤法
• 2.2.2 CTAB法
• 2.2.3 SDS+Tris-HCl洗涤法
• 2.2.4 SDS法
• 2.3 DNA质量检测
• 2.4 AFLP-PCR扩增反应
• 2.5 提取25份DNA模板
• 3 结果与分析
• 3.1 不同植物体部位的DNA品质与产量
• 3.2 不同提取方法对红花檵木DNA质量与产量的影响
• 3.3 25份红花檵木DNA检测结果
• 3.4 2份红花檵木DNA模板的PCR扩增结果
• 4 讨论
• 4.1 红花檵木基因组DNA提取方法
• 4.2 红花檵木基因组DNA提取时对材料的要求
• 4.3 所提红花檵木DNA质量的可靠性
• 第三章 红花檵木SRAP标记反应体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA的提取
• 1.2.2 PCR反应体系、程序与检测
• 2 结果分析
• 2.1 DNA电泳检测结果
• 2+浓度对SRAP反应的影响'>2.2 Mg²⁺浓度对SRAP反应的影响
• 2.3 dNTPs浓度对SRAP反应的影响
• 2.4 模板量对SRAP反应的影响
• 2.5 TaqDNA聚合酶量对SRAP反应的影响
• 2.6 引物浓度对SRAP反应的影响
• 2.7 退火温度优化
• 2.8 循环次数优化
• 3 小结
• 第四章 红花檵木的AFLP与SRAP分析
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 AFLP分析
• 2.1.2 引物筛选
• 2.1.3 反应产物检测与数据分析
• 2.2 SRAP分析
• 2.2.1 反应体系,反应程序
• 2.2.2 引物筛选
• 2.2.3 反应产物检测与数据分析
• 2.3 AFLP与SRAP联合数据比较分析
• 2.4 各檵木供试材料间亲缘关系与进化研究
• 3 结果与分析
• 3.1 红花檵木AFLP分析
• 3.1.1 红花檵木AFLP扩增结果
• 3.1.2 AFLP标记的遗传相似性和聚类分析
• 3.2 红花檵木SRAP分析
• 3.2.1 红花檵木SRAP扩增结果
• 3.2.2 SRAP标记的遗传相似性与聚类关系
• 3.3 红花檵木AFLP与SRAP联合数据分析
• 3.3.1 联合数据分析结果
• 3.3.2 联合数据分析所得的遗传相似性与聚类关系
• 3.3.3 一致性分析
• 3.4 檵木变种间的亲缘关系
• 3.4.1 AFLP分析结果
• 3.4.2 SRAP分析结果
• 3.4.3 联合分析结果
• 3.4.4 一致性分析
• 4 讨论
• 4.1 红花檵木资源的多样性
• 4.2 AFLP标记和SRAP标记多态位点数的有效性
• 4.3 AFLP分类与形态分类的比较
• 4.4 SRAP分类与形态分类的比较
• 4.5 AFLP分析、SRAP分析、联合分析的比较研究
• 4.6 AFLP与SRAP分析存在不同的原因
• 第五章 全文总结与创新之处
• 1 全文总结
• 1.1 红花檵木DNA提取
• 1.2 红花檵木SRAP分析体系的建立
• 1.3 AFLP、SRAP、联合数据分析
• 2 文章创新之处
• 3 展望
• 参考文献
• 附图
• 1.AFLP分析的部分扩增结果
• 2.SRAP分析的部分扩增结果
• 致谢
• 作者简介